Как нейросети превзошли эволюцию и создали невиданные в природе белки

В 2012 году Дженнифер Даудна и Эмманюэль Шарпантье описали технологию модификации генома с применением комплекса CRISPR-Cas9, за что спустя восемь лет были удостоены Нобелевской премии по химии.

В недавней публикации исследовательская группа под руководством Даудны представила в журнале Science подход к белковой инженерии на базе алгоритмов машинного обучения. Ученые спроектировали ультракомпактные нуклеазы, не существующие в живой природе, и подтвердили их функциональность на бактериальных культурах, а также на клетках растений и человека. Отдельные варианты ферментов превзошли по эффективности исходный природный белок. Зачем биомедицине синтетические молекулярные инструменты и к чему приведет слияние геномики и ИИ — разберем детально.

Эволюционные изобретения бактериального мира

Микроорганизмы ведут постоянную борьбу с бактериофагами — вирусами, внедряющими чужеродную ДНК внутрь бактерии для сборки новых вирусных частиц. В ходе эволюции многие прокариоты выработали специализированную систему иммунной памяти, получившую название CRISPR.

Внутри этого локуса между повторяющимися участками встроены спейсеры — захваченные фрагменты геномов ранее атаковавших патогенов. При повторной инвазии бактериальная клетка транскрибирует соответствующий спейсер в короткую РНК. Эта молекула направляет эндонуклеазу Cas точно к комплементарной вирусной последовательности, после чего фермент расщепляет чужеродную ДНК. Исследователям оставалось адаптировать этот естественный защитный щит для направленного разрезания произвольно выбранных участков генома.

Технологический прорыв 2012 года

До внедрения CRISPR ученым приходилось конструировать уникальный белковый домен под каждую отдельную мишень, что делало процесс крайне трудоемким и медленным. В 2012 году Мартин Йинек, Дженнифер Даудна, Эмманюэль Шарпантье с коллегами продемонстрировали универсальную платформу CRISPR-Cas9.

Авторы расшифровали механизм работы Cas9 и показали возможность его перенацеливания с помощью синтетической РНК. Две раздельные природные молекулы РНК были объединены в единую гидовую цепь (single-guide RNA, sgRNA).

Схема функционирования системы включает следующие фазы:

• комплекс Cas9–sgRNA находит короткий сигнальный мотив PAM, прилегающий к целевой области;

• гидовая РНК осуществляет проверку комплементарности соседнего сегмента ДНК, после чего нуклеаза производит двухцепочечный разрыв.

Само по себе внесение разрыва — лишь начальный этап: финальное редактирование реализуется за счет клеточных механизмов репарации. Если предоставить клетке донорную матрицу, поврежденный участок можно заменить нужной последовательностью, однако такая гомологичная репарация протекает значительно сложнее и доступна не во всех типах тканей.

В начале 2013 года сразу несколько коллективов успешно протестировали Cas9 на клетках млекопитающих, включая человеческие линии. Спустя восемь лет после фундаментального открытия авторы методики были удостоены Нобелевской премии.

Практическое применение точечного вмешательства в ДНК

Возможность селективного отключения определенных генов открыла путь к масштабным биотехнологическим применениям. В сельском хозяйстве это позволяет создавать сорта, защищенные от засухи, низких температур, болезней и насекомых-вредителей. В практической медицине адресная модификация генов служит мощным инструментом борьбы с тяжелыми наследственными заболеваниями.

Темпы развития технологий опережали формирование биоэтических норм. В 2018 году китайский биофизик Хэ Цзянькуй осуществил модификацию эмбрионов человека с помощью Cas9, отключив ген CCR5, ответственный за инфицирование клеток вирусом ВИЧ.

Мировое научное сообщество подвергло эксперимент резкой критике за нарушение протоколов, отсутствие прямой клинической необходимости и непредсказуемые последствия для потомства. В результате судебного процесса исследователь был приговорен к трем годам тюремного заключения.

Несмотря на резонанс, рожденные дети развиваются нормально, а сам Хэ после освобождения продолжил научную деятельность.

Отношение регулирующих органов к генетической терапии постепенно трансформируется. В 2023 году регуляторы Великобритании впервые одобрили клиническое применение CRISPR-препарата для лечения серповидноклеточной анемии и трансфузионно-зависимой бета-талассемии. Терапия включает забор аутологичных стволовых клеток пациента, целенаправленную модификацию энхансера гена BCL11A и последующую реинфузию биоматериала.

Тем не менее, если работа с клетками ex vivo уже стандартизирована, ключевым барьером для широкой медицины остается прямая in vivo доставка компонентов редактора в ткани пациента.

Ограничения габаритов классического Cas9

Нуклеаза SpCas9 из Streptococcus pyogenes включает 1368 аминокислотных остатков, а ее кодирующая ДНК занимает около 4,1 тыс. пар оснований (п. о.). Главным инструментом адресной доставки в организме служат рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (AAV). Вектор сохраняет лишь вирусный капсид с полезной емкостью не более 4,7 тыс. п. о. Ген SpCas9 занимает практически весь этот объем, не оставляя пространства для кассеты гидовой РНК, промоторов и регуляторных участков.

Размер — не единственное ограничение: природный фермент может осуществлять нецелевые разрезы (off-target), провоцировать иммунный ответ и демонстрировать нестабильную эффективность в различных тканях.

Причина в том, что природный Cas9 эволюционировал исключительно как фактор бактериальной защиты. По этой причине исследователи ведут непрерывный поиск альтернативных, более миниатюрных нуклеаз, среди которых особое внимание привлекает белок TnpB.

TnpB: компактный предок систем Cas12

Ген TnpB локализован внутри мобильных генетических элементов семейства IS200/IS605 — транспозонов, способных перемещаться по геному клетки.

В 2021 году две независимые исследовательские группы опубликовали в Science доказательства того, что TnpB представляет собой функциональную РНК-направляемую нуклеазу: белок использует направляющую РНК, распознает мотив TAM и расщепляет ДНК. По молекулярной организации TnpB является эволюционным предшественником семейства Cas12.

Фермент TnpB из бактерии Deinococcus radiodurans состоит всего из 408 аминокислот, а его кодирующая последовательность составляет ~1,2 тыс. п. о. Это позволяет без труда разместить полный терапевтический комплекс вместе с промоторами и sgRNA в едином векторе AAV.

Однако природный TnpB пока не готов к роли универсального терапевтического средства: его активность сильно зависит от клеточного контекста, а специфические требования к последовательности TAM сужают выбор потенциальных мишеней.

Перед исследователями стояла задача кардинально улучшить функциональные характеристики компактного фермента, для чего команда Даудны применила генеративные нейросетевые модели.

Генеративное проектирование ферментов с помощью ИИ

В опубликованной работе ученые задействовали модель ESM-IF1, предназначенную для решения задачи обратного фолдинга (inverse protein folding). В отличие от AlphaFold, предсказывающей трехмерную форму по первичной аминокислотной цепи, алгоритм ESM-IF1 получает готовую конформацию и генерирует новые варианты последовательностей, способные принять заданную геометрию.

Процесс генерации требовал строгих биофизических ограничений: рабочий TnpB обязан координировать гидовую РНК, связываться с дуплексом ДНК, валидировать сайт TAM и выполнять каталитический акт гидролиза фосфодиэфирной связи.

Сравнительный анализ гомологов TnpB позволил выделить эволюционно консервативные аминокислоты, формирующие критические интерфейсы взаимодействия. Эти позиции оставили неизменными, разрешив нейросети модифицировать только гибкие и вариабельные участки.

Фермент разделили на два структурных модуля: узнающую лопасть REC и каталитический домен NUC. Модель рассчитала независимые пулы модификаций для каждого домена.

После вычислительной фильтрации авторы отобрали 44 варианта REC и 45 вариантов NUC. Скомбинировав их между собой, исследователи получили библиотеку из 1980 полноразмерных ферментов. Синтезированные конструкции прошли скрининг в бактериальных тест-системах, а наиболее активные белки были испытаны на протопластах растений и культуре клеток человека.

Из 1980 спроектированных ферментов 466 (почти 24%) сохранили активность в бактериях, а около 8% превзошли природный аналог TnpB по эффективности. Для белковой инженерии de novo это выдающийся показатель, поскольку множественные мутации обычно приводят к дестабилизации третичной структуры или потере каталитических свойств.

Предшествующие разработки в области ИИ-дизайна редакторов

Создание нуклеаз искусственным интеллектом развивалось параллельно несколькими группами. В 2024 году компания Profluent анонсировала проект OpenCRISPR-1 — сгенерированный большой белковой языковой моделью аналог Cas9, детали которого позднее были опубликованы в Nature.

Модель Profluent обучалась на огромном массиве природных CRISPR-систем и генерировала последовательности напрямую, без предварительной фиксации трехмерного каркаса. Из сотен тысяч кандидатов для валидации в лаборатории отобрали 209 вариантов. OpenCRISPR-1 воспроизвел каталитический потенциал Cas9, снизив при этом медианную частоту нецелевых разрезов с 6,1% до 0,32%.

При этом OpenCRISPR-1 состоит из 1380 аминокислот и сохраняет проблему избыточной молекулярной массы. Группа Даудны пошла по пути модификации миниатюрного TnpB, показав масштаб вариативности первичной структуры, сохраняющий функциональную активность.

Преодоление ограничений природной эволюции

Новая методология формирует универсальный вычислительный конвейер, позволяющий проектировать семейства редакторов под жесткие биотехнологические требования: сверхмалый размер, устойчивость к температурным перепадам, повышенную кинетику в определенных тканях или распознавание нестандартных TAM-мотивов.

Если ранее ученые годами оптимизировали редкие природные изоляты с помощью направленного мутагенеза, то теперь конструирование ферментов можно начинать с целевой структуры, параллельно синтезируя и тестируя сотни оптимизированных конфигураций.

Существующие вызовы и открытые вопросы

Полученные варианты SynTnpB пока не готовы к терапевтическому использованию у человека: их свойства исследовались исключительно in vitro на бактериях, растительных протопластах и клеточных культурах. Испытания на животных моделях, анализ системной доставки и клинические тесты еще предстоят.

Перед трансляцией в клинику потребуется полногеномное профилирование нецелевой активности, оценка иммуногенности, кинетики деградации и безопасности при длительной экспрессии. В клеточных тестах варианты вели себя неодинаково: версия v1 продемонстрировала высокую селективность, тогда как варианты v5 и v7 показали повышенное количество внецелевых разрезов. Глубокое отличие аминокислотной последовательности от природных белков способно как снизить риск взаимодействия с предсуществующими антителами, так и сформировать новые антигенные эпитопы. Оценку этих факторов предстоит экспериментально провести исследователям в лаборатории.

Напишите в комментариях, воспользовались бы вы технологией точечного редактирования генома для устранения наследственной предрасположенности или аллергии? Какие риски вызывают у вас наибольшие опасения?

* Компания Meta Platforms Inc. признана экстремистской организацией, ее деятельность запрещена на территории Российской Федерации.

 

Источник