Учёные впервые засняли запуск репликации ДНК в живой клетке и раскрыли механизм расплетения генома

Исследователям впервые удалось детально отследить механизм инициации репликации ДНК в живых клетках с беспрецедентным пространственным разрешением.

Перед делением любая клетка обязана безупречно скопировать свой генетический материал. Эту задачу выполняют специализированные молекулярные моторы — хеликазы, ферменты, разрывающие водородные связи между цепями двойной спирали. Ключевую роль в запуске этого процесса у эукариот играет белковый комплекс MCM2-7.

Данная структура объединяет шесть уникальных субъединиц (от Mcm2 до Mcm7). В неактивном состоянии этот гексамер формирует сдвоенное кольцо, охватывающее нить ДНК в зонах начала репликации. До сих пор ученым не удавалось зарегистрировать в реальном времени момент расхождения этих колец, точную локализацию первичного расплетания и траекторию выхода одной из цепей наружу.

Чтобы детально изучить переходные этапы, генетики задействовали методы химической генетики на модельных организмах дрожжей. С помощью искусственных молекулярных связок специалисты зафиксировали соседние субъединицы Mcm4 (в одном кольце) и Mcm5 (в другом). Подобная блокировка расхождения колец закономерно привела к заморозке клеточного цикла и падению интенсивности синтеза ДНК более чем на 70% спустя час после выхода из фазы покоя G1.

Полученные данные доказали, что механическое разделение двойного кольца выступает обязательным триггером для высвобождения ключевых активаторных белков Sld3 и Mcm10.

Детальный анализ всех шести потенциальных интерфейсов взаимодействия показал, что роль своеобразного шлюза для вывода одной из цепей ДНК выполняет контакт между субъединицами Mcm2 и Mcm5. Нарушение работы этого участка позволяет инициировать первичное плавление спирали, однако полностью блокирует дальнейшую элонгацию: активированные хеликазы оказываются неспособны преодолеть преграду из-за запертых ворот.

Подобные структурные дефекты неизбежно приводящие к гибели клеток.

Задействовав передовые методы высокоточного геномного картирования (ChIP-Exo 5.0 и PIP-seq), эксперты установили, что первичное разделение цепей зарождается строго по центру — в зоне смыкания двух белковых колец. Эта область ДНК обладает уникальной архитектурой: плотное ядро окружено легко уязвимыми нуклеотидными последовательностями. Под механическим напором белкового мотора спираль в этом месте деформируется и мгновенно расходится.

Исследование одноцепочечных промежуточных продуктов выявило появление первых расплетенных участков уже через 15 минут после входа клеток в фазу синтеза. Авторы зафиксировали, как зона контакта белка с нуклеиновой кислотой последовательно увеличивается с 64 до 72, а затем до 138 пар оснований по мере диссоциации колец и рекрутинга полимераз.

Данная работа объединила разрозненные этапы инициации удвоения ДНК в единую непрерывную хронологию: от раскрытия белковых колец и вытягивания одиночной нити через шлюз до расхождения репликативных машин в противоположных направлениях. Поскольку архитектура этих базовых белков консервативна у дрожжей и человека, расшифровка их точной механики поможет понять механизмы поддержания стабильности генома и предотвращения онкогенных мутаций, возникающих из-за сбоев репликации.

Источник: iXBT