Как эксперимент по внедрению человеческих клеток в мозг мышей изменил ход науки

Писатели-фантасты то и дело возвращаются к концепции искусственного создания мозга. Мотивы могут быть самыми разными — от создания основы для андроида до проектирования биокомпьютера. Насколько же эти сюжеты воплотимы в действительности? Научному сообществу уже давно под силу культивировать человеческие нейроны in vitro, собирая из них миниатюрные трехмерные структуры — органоиды. Полноценным аналогом живого органа их назвать сложно: у таких новообразований отсутствует развитая кровеносная сеть, рецепторный аппарат и способность инициировать двигательную активность.

Впрочем, существуют обходные маневры. Так, группа специалистов предприняла попытку объединить мышиную и человеческую нервные системы. Звучит несколько пугающе, не так ли? Биологи вывели линию грызунов, у которых практически не формировались собственные кора и гиппокамп, а затем поместили в образовавшийся анатомический резервуар человеческие органоиды. Трансплантаты успешно прижились, значительно увеличились в объеме и интегрировались в местную нейронную сеть. Отдельные отростки проросли даже в спинной мозг. Давайте разберем механику этого эксперимента и его ключевые итоги, а заодно объясним, почему некорректно именовать подопытных особей «мышами с человеческим разумом».

Зачем вообще понадобилась пересадка

Ключевая цель заключалась в том, чтобы запустить развитие человеческой нервной ткани не в чашке Петри, а в условиях живого организма. В чем преимущества такого подхода? Ткань беспрепятственно снабжается кислородом и нутриентами через кровеносное русло, принимает сигналы от смежных отделов мозга и способна выстраивать протяженные синаптические пути. Более того, исследователи получают возможность наблюдать, как динамика нейронной активности отражается на моторных функциях, когнитивных способностях и поведенческих паттернах подопытного. В лабораторных условиях проследить столь сложную цепочку не представляется возможным. Именно поэтому исследователи стремились превратить изолированный органоид в полноправный элемент функционирующей нервной системы.

Классическая методика предполагает выращивание органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Для этого соматические клетки (например, кожи или крови) перепрограммируют до эмбрионального состояния, после чего задают им вектор дифференцировки. Спустя время формируется клеточный конгломерат, состоящий из нейронов, астроцитов и их предшественников. Хотя он имитирует ранние стадии кортикального онтогенеза, полноценным мозгом его назвать нельзя. У него отсутствуют полноценное кровоснабжение, органы чувств и соматическая связь (ввиду изначального отсутствия тела).

Команда под руководством Серджиу Паски ранее уже пыталась разрешить эту задачу, имплантируя человеческие органоиды новорожденным крысам. Внутри живого мозга клетки действительно демонстрировали более интенсивное созревание, увеличивались в размерах и активно ветвились. Они также образовывали синапсы с локальными нейронными сетями, причем спустя полгода трансплантат занимал около трети объема одного полушария. Дальнейшему экспансивному росту препятствовали нативная кора животного и дефицит свободного пространства. Помимо прочего, крысиные нейроны развивались опережающими темпами и занимали доступные пути раньше человеческих.

В рамках нового исследования ученые решили элиминировать этот фактор межвидовой конкуренции. Для этого они вывели лабораторных мышей, чей неокортексы и гиппокамп практически не развивались в эмбриогенезе. В результате в черепной коробке таких животных оставался свободный анатомический зазор, куда удавалось трансплантировать сразу несколько органоидов. Пересаженная ткань обеспечивалась кровотоком и получала доступ к уцелевшим сегментам нервной системы, практически не сталкиваясь с резидентными кортикальными нейронами. Такой подход позволил оценить реальный потенциал человеческих клеток к развитию и интеграции, когда нативные преграды полностью отсутствуют.

Как получили мышей почти без коры

Стоит подробнее остановиться на методологии выведения столь специфических животных. Исследователям пришлось преодолеть ряд технологических трудностей. Была получена уникальная линия иммунодефицитных мышей, у которых инактивировали ген Esco2 в клеточной популяции с маркером Emx1. Именно из этих клеток в процессе эмбриогенеза формируется львиная доля неокортекса и гиппокампа. Дефицит Esco2 приводил к гибели делящихся клеток-предшественников, из-за чего целевые зоны практически не закладывались.

В мозге половозрелых особей сохранялось всего около 2% от нормального объема кортикальной ткани, а общая масса органа уменьшалась примерно вдвое. Примечательно, что животные демонстрировали полную жизнеспособность, что подчеркивает колоссальный адаптационный потенциал млекопитающих. Мыши доживали до взрослого состояния, свободно передвигались и сохраняли базовые безусловные рефлексы. Правда, в период раннего развития за потомством требовался более щепетильный уход: их позже отлучали от материнского вскармливания и переводили на высококалорийный рацион.

Полученных особей классифицировали как апаллиальных — то есть появившихся на свет с недоразвитым паллиумом, который служит эволюционным зачатком коры и гиппокампа. Важно акцентировать внимание: эти структуры не подвергались хирургической деструкции, они просто не сформировались в период внутриутробного развития. При этом мозжечок, стволовые отделы и подкорковые ядра оставались нетронутыми и функционировали в штатном режиме. На месте привычной коры в верхней части черепа образовалась обширная полость, заполненная ликвором. Именно в эту зону ученые и инъецировали человеческие органоиды.

Операцию проводили на вторые сутки после рождения. Каждому грызуну вводили по четыре органоида, культивировавшихся в течение двух месяцев. Каждый такой фрагмент насчитывал порядка ста тысяч клеток. Иммунную систему реципиентов предварительно угнетали во избежание отторжения ксеногенного материала. В итоге успешная приживляемость трансплантатов составила впечатляющие 86,2%.

Что выросло внутри мышиного мозга

После имплантации органоиды не просто адаптировались в организме хозяина, но и продемонстрировали стремительный рост. В период между вторым и третьим месяцами их объем увеличился в среднем в 4,7 раза. К исходу третьего месяца человеческий трансплантат формировал 91,9% от суммарного объема кортикальной ткани в зоне дефекта. Здесь необходима важная ремарка: речь идет не о 92% всего мышиного мозга (о чем поспешили заявить некоторые СМИ), а исключительно о той области, где изначальная кора фактически отсутствовала.

Гистологический анализ показал, что пересаженные ткани претерпели не просто количественное увеличение, но и качественную дифференцировку. Внутри них развились специализированные клеточные популяции: глутаматергические нейроны различных субтипов, астроциты, клетки-предшественники и элементы субпластинки. Родственные типы клеток локализовались кластерами, что свидетельствует о процессах спонтанной самоорганизации трансплантата. Тем не менее, сформировать полноценное полушарие с четкой слоистой архитектоникой, бороздами и обособленными функциональными зонами не удалось.

Особый научный интерес представляет обнаружение проекционных нейронов пятого слоя (L5-ET). Их отличительной чертой являются протяженные аксоны, покидающие пределы больших полушарий и соединяющие кору с удаленными структурами ЦНС. В стандартных органоидах подобные элементы почти не образуются. Сопоставив данные по 213 753 нейронам, выращенным в лабораторных условиях различными методами, ученые обнаружили всего три клетки с соответствующим фенотипом. В новом же эксперименте такие нейроны возникали примерно втрое чаще по сравнению с предыдущими протоколами трансплантации.

Среди этих проекционных нейронов были идентифицированы клетки, морфологически напоминающие веретенообразные нейроны. Они характеризуются крупным сомой и удлиненными отростками. В человеческом мозге эти клетки концентрируются в зонах, отвечающих за социальные взаимодействия, эмоциональный интеллект и принятие решений. Долгое время они считались уникальным приобретением эволюции человека, однако позже схожие структуры были найдены у приматов, слонов и китообразных. Получить их in vitro ранее не удавалось, поэтому появление таких элементов внутри химерного мозга указывает на более глубокое и естественное созревание нервной ткани. Впрочем, авторы работы предпочитают называть их «подобными веретенообразным нейронам», поскольку внешнего сходства и экспрессии ключевых маркеров пока недостаточно для окончательного утверждения об их идентичности.

Куда добрались человеческие нейроны

Отростки пересаженных клеток вышли далеко за пределы сформировавшейся полости. Они преодолели барьеры подкорковых структур, достигли верхних холмиков четверохолмия и организовались в структурированные тракты. Фиксировался и ретроградный поток сигналов: основными их источниками выступали палеокортекс, таламус и бледный шар. Это свидетельствует о том, что человеческий имплантат успешно интегрировался в нейросети мышиного мозга и включился в их работу.

Отдельные аксоны проросли еще глубже — вплоть до шейного сегмента спинного мозга. Их человеческое происхождение подтвердилось с помощью специфических антител к цитоплазматическому антигену человека. В контрольной группе мышей, которым миниатюрный органоид пересаживали в интактную кору, подобных проекций не обнаружили. По всей видимости, именно наличие свободного пространства позволило нейронам сформировать протяженные нисходящие пути. Тем не менее, сам факт наличия аксона еще не доказывает его способность напрямую управлять мускулатурой животного.

Чтобы выяснить, функционирует ли пересаженная ткань как единый ансамбль, исследователи встроили в часть клеток ген флуоресцентного белка GCaMP8s. Он чувствителен к ионам кальция: при возбуждении нейрона концентрация Ca внутри него возрастает, и GCaMP8s начинает светиться ярче.

Перед началом мониторинга кости черепа грызунов сделали оптически прозрачными, что позволило фиксировать эти флуктуации с помощью высокочувствительной камеры. Выяснилось, что нейронная активность носила не локальный, а когерентный характер, распространяясь по всему трансплантату в виде согласованных волн. Каждое такое событие за зарождалось в локальной зоне, в течение примерно ста миллисекунд охватывало всю доступную поверхность и продолжалось на протяжении десятков секунд. Последующие электрофизиологические измерения с погружением электрода в ткани полностью подтвердили эти наблюдения, доказав, что камера регистрирует именно биоэлектрическую активность нейронов, а не артефакты движения или гемодинамики.

Активность трансплантата коррелировала по времени с движениями мышиной морды. Однако однозначной трактовки этого феномена пока нет. Человеческие нейроны вполне могли получать афферентную обратную связь уже по факту совершения движения. В то же время нельзя исключать их прямое участие в инициировании моторных актов. Для верификации этой гипотезы авторам предстоит провести эксперименты с селективным отключением отдельных синаптических связей. Тем не менее, полученные результаты выглядят весьма обнадеживающе.

Что произошло с поведением животных?

В ходе поведенческого анализа исследователи сопоставили показатели трех групп: интактных мышей, апаллиальных особей (лишенных коры и гиппокампа) и ксенокортикальных мышей с инкорпорированными человеческими органоидами. При свободном перемещении все подопытные демонстрировали сопоставимую скорость передвижения. Существенные различия выявились лишь при прохождении специализированных тестов.

Первоначально тестированию подверглись апаллиальные мыши без трансплантата. Их пустили по дорожке со специальным трекингом лап. В то время как здоровые животные демонстрировали строгую диагональную синхронность движений конечностей, у лишенных коры особей этот паттерн нарушался. Кроме того, вариативность двигательных актов у них была выше как между разными особями, так и от сессии к сессии. Это указывает на то, что уцелевшие подкорковые структуры способны поддерживать базовую локомоцию, но испытывают дефицит в механизмах тонкой моторики.

У ксенокортикальных мышей после трансплантации часть этих моторных дефицитов нивелировалась. Они уверенно передвигались, а некоторые параметры походки приблизились к показателям контрольной группы. Тем не менее, координация движений лап все же оставалась несовершенной по сравнению со здоровыми животными. Наблюдались и другие поведенческие особенности: такие особи реже заходили в открытый центр арены и реже вставали на задние лапы. Инкорпорированная человеческая ткань оказала заметное модулирующее влияние на ЦНС, однако не смогла полностью компенсировать утрату нативной коры.

Рабочую память оценивали в Y-образном лабиринте. Здоровый грызуן демонстрирует исследовательское поведение, стремясь посетить неизведанный рукав, что требует удержания в памяти уже пройденных маршрутов. Особи из контрольной и ксенокортикальной групп справились с тестом значительно лучше уровня случайного выбора, в то время как апаллиальные мыши его провалили. Данный эффект был воспроизведен на двух независимых выборках, хотя делать преждевременные выводы о появлении «человеческих когнитивных способностей», разумеется, не стоит.

В ходе еще одного эксперимента мышей обучали устанавливать ассоциативную связь между звуковым сигналом и слабым ударом током. Обе экспериментальные группы продемонстрировали худшие результаты по сравнению с контролем. Трансплантация помогла частично компенсировать лишь часть утраченных функций, но не восстановила работу поврежденных отделов в полном объеме. Такой итог вполне закономерен: человеческий трансплантат оставался на относительно ранней стадии развития и не воссоздавал сложнейшую цитоархитектонику естественной коры.

Каков же главный итог? Ученые создали уникальную промежуточную модель, занимающую нишу между изолированным органоидом и традиционными зоологическими опытами. Человеческие клетки развиваются в живом организме, формируют протяженные нейронные сети и позволяют коррелировать динамику нервной ткани с поведенческими реакциями грызуна. Данный инструмент открывает новые перспективы для изучения ранних этапов онтогенеза мозговых патологий и тестирования фармакологических препаратов в условиях, недоступных для стандартных лабораторных тестов. Что принципиально важно: трансплантат сохраняет незрелый фенотип и никоим образом не превращает подопытное животное в существо с человеческим разумом.

 

Источник