Изучение транскутанного проникновения эпигаллокатехин галлата (EGCG)

2 часа назад Прокомментировать Просмотры: 4

Введение

Исследование кинетики transdermal-проникновения веществ через кожу остаётся важной задачей современной фармакологии: оно необходимо при разработке наружных лекарственных средств и косметических препаратов. Классическим инструментом для таких экспериментов служит ячейка Франца — установка, состоящая из донорной и акцепторной камер, между которыми располагается мембрана. В роли мембраны могут выступать кожа разных млекопитающих, рептилий и человека, в том числе трупный материал, а также синтетические материалы. В нашей работе мы использовали кожу свиного уха, поскольку по своим свойствам она наиболее близка к коже человека. Эпигаллокатехин галлат (EGCG) — природный полифенол зелёного чая. Его активно изучают с прицелом на медицинское и косметологическое применение, прежде всего из-за противораковых свойств. Он является мощным антиоксидантом, оказывает противовоспалительное действие, а по некоторым данным ещё и ингибирует 5-альфа-редуктазу. EGCG — гидрофильная молекула, хорошо растворимая в воде, поэтому его проницаемость может быть достаточно низкой, что ограничивает возможности его использования в косметике. Цель работы заключалась в определении кинетических параметров проницаемости EGCG и его накопления в коже.

Методика исследования

Эксперименты проводили на коже со средней части внешней стороны свиного уха в ячейках Франца. В донорную камеру вносили 1 мл 1% раствора EGCG, а акцепторную заполняли физиологическим раствором.

Итак, на поверхность кожи в ячейке Франца наносили 1 мл 1% раствора EGCG в физиологическом растворе, а противоположную часть ячейки заполняли водой. Систему выдерживали 8 часов, отбирая из акцепторной части пробы через 0,5, 1, 2, 4 и 8 часов для определения содержания EGCG методом ВЭЖХ. По завершении эксперимента кожу извлекали из ячейки и вырезали рабочий участок, контактировавший с раствором. Его просушивали бумажным полотенцем, трижды снимали верхний наружный слой с помощью скотча, взвешивали и замораживали в жидком азоте, после чего измельчали. К измельчённому образцу добавляли 1 мл 0,1% раствора трипсина и помещали его в термостат с покачиванием при 37 °C на 12 часов. Затем образец гомогенизировали ультразвуком до однородного состояния. К полученным гомогенатам добавляли 2 мл 70% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и встряхивали на Vortex в течение двух минут. После этого пробы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант использовали для количественного определения EGCG методом ВЭЖХ. Измерения выполняли при скорости потока 150 мкл/мин и температуре термостата 40 °C. Элюент А — LiClO₄ 0,2 М и HClO₄ 0,05 М, элюент Б — ацетонитрил. Использовали линейный градиент от 5% до 50% Б за 2000 мкл и колонку Prontosil 120-5-C18 AQ.

Результаты

На рисунке 1 показан график накопления EGCG в акцепторной камере во времени: приведены средние значения с учётом стандартной ошибки.

Рисунок 1. График накопления EGCG в акцепторной камере во времени (средние значения с учётом стандартной ошибки).

В таблице 2 представлены данные о накоплении EGCG в коже в зависимости от времени контакта с донорной камерой. Кривая кинетики накопления по средним значениям приведена на рисунке 2.

Таблица 2. Количество EGCG в коже в зависимости от времени.

Время, ч	2	4	8
Значение, мкг/г	19,9	31,3	73,69
Значение, мкг/г	—	42,64	74,54
Среднее знач.	0	36,97	74,11
Станд. ошибка	0	5,67	0,43

Рисунок 2. График накопления EGCG в коже во времени (средние значения с учётом стандартной ошибки).

Расчёт скорости проницаемости

В условиях «бесконечной дозы» (когда концентрация в донорной камере остаётся практически неизменной) после выхода на стационарный режим поток описывается первым законом Фика:J_ss=K_p*ΔC

где:

J_ss — стационарный поток (мкг·см⁻²·ч⁻¹);

K_p — коэффициент проницаемости кожи (см/ч);

ΔC — разность концентраций вещества по обе стороны рогового слоя.

Экспериментально J_ss определяют как наклон линейного участка зависимости количества проникшего вещества от времени, нормированный на площадь диффузии:J_ss=dQ/A*dt

где:

Q — кумулятивное количество вещества в рецепторной камере,

A — площадь кожи в ячейке,

t — время.

Если известны J_ss и ΔC, коэффициент проницаемости вычисляют по формуле:

K_p= J_ss/ ΔC

Коэффициент проницаемости K_p с учётом толщины слоя мембраны рассчитывается так:

K_p= J_ss/ C_donor

Коэффициент проницаемости P, связанный с толщиной мембраны, находят следующим образом:

P=K_p*h

где h — толщина слоя.

Стационарный поток:	*J_ss~0,176 мкгсм^-2ч^-1*
Коэффициент проницаемости кожи:	*K_p~1,7510^-5см/ч**
Пермеанс с учётом толщины:	*P~2,310^-6 см²/ч**

Накопление в коже

t=120 мин. 19,90 мкг/г

t=240 мин. 36,97 мкг/г

t=480 мин. 74,11 мкг/г

Линейная аппроксимация Q_skin (t)

dQ_skin/dt~9,07 мкг*г^-1*ч^-1

Для всей массы кожи в ячейке:

dQ_skin,total/dt=9,07 мкг/г*ч * 0,333 г ~3,02 мкг/ч

Суммарный поток через кожу (кожа + акцептор)

Общая скорость поступления вещества из донора:

dQ_skin,total/dt=dQ_acc+dQ_{ski, total}/dt~0,406+3,02~ 3,43 мкг/ч

Суммарный стационарный поток:

J_total=dQ_total/dt/A=3,43/2,3116~1,48 мкг*см^-2*ч^-1

Коэффициент проницаемости с учётом накопления в коже:

K_p,total=J_total/C_donor=1,48/10000~1,48*10^-4 см/ч

Пермеанс:

P_total=K_p,total*h~1,48*10^-4*0,1311~1,94*10^-5 см²/ч

Итог с учётом количества вещества в коже:

Суммарный стационарный поток	*J_total~1,48 мкгсм^-2ч^-1*
Коэффициент проницаемости	*K_p,total~1,4810^-4 см/ч**
Пермеанс	*P_total~1,9410^-5 см²/ч**
Скорость поступления в акцептор	dQ_acc/dt~0,406 мкг/ч
Скорость накопления вещества в коже	dQ_{skin, total}/dt/dQ_total/dt=3,02/3,43~0,88

Выводы

В ходе работы мы изучили проницаемость EGCG в ячейках Франца, где мембраной служила кожа с внешней стороны свиного уха. Были установлены кинетика проникновения EGCG в акцепторную камеру и кинетика его накопления непосредственно в коже.

Измеренный коэффициент проницаемости составил K_p,total~1,48*10^-4 см/ч. По принятой градации проницаемости значения K_p~10^-7-10^-8 см/с считаются низкими (характерны для крупных гидрофильных молекул), K_p~10^-6-10^-7 см/с — умеренными (липофильные низкомолекулярные соединения), а значения выше 10^-6 см/с — высокими (очень липофильные небольшие молекулы с энхансерами). Полученная величина K_p~1,48*10^-4 см/ч, или ~4,1*10^-8 см/с, лежит вблизи верхней границы низкого диапазона и нижней границы умеренного, что в целом типично для молекул такого рода.

Что касается накопления вещества в коже, то здесь она выступает не барьером, а своеобразным депо. За время эксперимента в кожу проникло в 7–8 раз больше EGCG, чем прошло сквозь неё в акцептор. Именно этот процесс является основным, тогда как транскожный перенос играет второстепенную роль.

Соотношение скоростей накопления (кожа/акцептор) составляет 7,5x. Это указывает на специфическое сродство вещества к структурам кожи.

Наши данные показывают, что EGCG хорошо проникает в кожу и удерживается в ней. Это ограничивает его применение в наружных средствах, для которых необходимо поступление в системный кровоток. Если же мишень находится непосредственно в коже, такое поведение вещества становится серьёзным преимуществом.

Исследование выполнено прекрасными людьми из STM-MATERIALS )

Эти люди:

Антон А.

Алексей П.

Источник