Исследователи представили инновационный метод комплексного изучения функций генов непосредственно в объёмных моделях человеческих тканей. Разработка базируется на синергии CRISPR-редактирования и органоидов — миниатюрных трёхмерных биоструктур, выращенных из плюрипотентных стволовых клеток. Этот подход позволил специалистам выявить ключевые гены, играющие решающую роль в закладке нервной системы на самых ранних этапах эмбриогенеза.
Работа, результаты которой опубликованы в научном издании eLife, была реализована группой экспертов из Гарвардского университета. Редакция журнала высоко оценила проект, назвав его прорывным инструментом для изучения процессов развития человека. Поскольку прямое вмешательство в эмбриональное развитие людей сопряжено с серьезными этическими и техническими барьерами, органоиды стали идеальной платформой, точно воспроизводящей ключевые стадии формирования тканей в контролируемых лабораторных условиях.
Фундаментальная сложность прежних методов генетического анализа органоидов заключалась в неоднородности редактирования. Традиционные техники приводили к частичной модификации, создавая «мозаичные» образцы, где лишь малая доля клеток несла нужные изменения. Это крайне затрудняло интерпретацию влияния конкретного гена на ткань в целом. Новейшая методика позволяет эффективно подавлять активность целевых генов во всех без исключения клетках органоида.
Для достижения такой точности авторы существенно переработали протокол подготовки CRISPR-систем. Вместо длительного и трудоемкого процесса клонирования отдельных клеток, требующего многократных пассажей, ученые оптимизировали последовательность операций и внедрили стадию интенсивной очистки ДНК на раннем этапе. Финальная доставка сконструированных векторов в клетки осуществляется при помощи вирусных носителей.
Дополнительно была усовершенствована технология производства самих вирусных векторов. Исследователи установили, что сокращение объемов питательных сред при культивировании клеток значительно увеличивает выход вирусных частиц, а синергия доставки вируса и высева стволовых клеток на субстрат позволяет добиться практически стопроцентной эффективности генетической модификации.
Для валидации метода была отобрана выборка из 77 генов, ответственных за развитие нервной трубки — фундаментальной структуры, из которой впоследствии формируются головной и спинной мозг. Сбои на этом этапе развития могут привести к фатальным порокам, таким как анэнцефалия.
Эксперименты выявили, что подавление экспрессии ZIC2, SOX11 и ZNF521 ведет к критическим дефектам. В частности, отсутствие ZIC2 и SOX11 приводило к тому, что нервная пластинка оставалась незакрытой, тогда как «отключение» ZNF521 вызывало множественные очаги дезорганизации. Углубленный анализ показал, что эти гены являются регуляторными хабами, управляющими каскадами других генов, отвечающих за нейрогенез.
По мнению разработчиков, созданная платформа радикально снижает временные и финансовые затраты на крупномасштабные генетические исследования. Это открывает новые перспективы в изучении молекулярной природы врожденных патологий и позволяет выявить перспективные терапевтические мишени для медицины будущего.
Источник: iXBT
