Если мы чего-то не видим — это не значит, что его нет. Данный принцип отлично описывает микромир, населенный вирусами, грибками и бактериями. Многие из них безобидны или даже приносят пользу, однако есть и те, что несут вред. Дабы бороться с вредными бактериями и способствовать развитию полезных, нужно четко понимать процессы и механизмы, опосредствующие их рост, развитие и размножение. В частности, важным фактором является среда обитания. Ученые из Калифорнийского технологического института (Пасадина, США) провели исследование бактерий, обитающий в полимерных жидкостях (например, слизь), установив, что они формируют необычные канатоподобные структуру. Как было сделано данное открытие, в чем необычность этих бактерий, и какова польза от данного открытия? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.
Основа исследования
Многие бактерии живут в полимерных жидкостях, таких как слизь, выстилающая дыхательные пути, кишечник и цервико-вагинальный тракт в организме, экзополимеры в океане и секретируемые клетками внеклеточные полимерные вещества (EPS от extracellular polymeric substance), которые инкапсулируют биопленки. Однако лабораторные исследования бактерий обычно сосредоточены на клетках в жидкостях без полимеров. В результате, несмотря на их распространенность, то, как внеклеточные полимеры влияют на поведение бактерий, остается плохо изученным. Недавние работы намекают на то, что взаимодействие с полимерами может кардинально изменить то, как отдельные подвижные клетки плавают и объединяются с другими клетками. Тем не менее возможное влияние полимеров на другую фундаментальную характеристику жизни бактерий — пространственную пролиферацию в многоклеточной колонии — остается неизвестным. Морфология колонии может быть биологически важной. Например, исследования бактерий, размножающихся на плоских поверхностях, показывают, что их получающиеся колонии могут демонстрировать различные морфологии, что, в свою очередь, может влиять на сигнализацию между клетками, генетическое разнообразие, а также устойчивость колонии и восприимчивость к внешним стрессорам. Поэтому авторы рассматриваемого нами сегодня труда попытались найти ответ на следующий вопрос: формируют ли взаимодействия с полимерами морфологию размножающихся бактериальных колоний?
Если коротко, то ответ на этот вопрос — да, но важно понимать и механизм данного процесса. В природе многие бактерии неподвижны или теряют подвижность, но все равно продолжают размножаться в колониях; действительно, потеря жгутиков часто связана с патогенезом и адаптацией бактерий к больным слизистым средам, таким как кистозный фиброз. Поэтому ученые сфокусировались на пространственной пролиферации палочковидных неподвижных мутантных клеток, у которых отсутствуют жгутики. Проводя эксперименты с этими бактериями в полимерных растворах, было обнаружено, что когда полимер достаточно сконцентрирован, клетки образуют крупномасштабные «кабели» по мере их размножения в колонии — в резком контрасте с образованием случайной дисперсии, как в традиционно изучаемом случае без полимера. Эта характерная морфология кабеля возникает независимо от изменений в типе клеток и составе полимера у трех различных видов бактерий и семи различных полимеров, включая муцины, ключевой компонент слизи в организме. Объединив эксперименты, теоретическое моделирование и агентное моделирование, ученые рассмотрели происхождение формирования кабеля до взаимодействия между вызванным полимером энтропийным притяжением между соседними клетками и их затрудненной способностью диффузионно отделяться друг от друга после роста и деления в вязком полимерном растворе. Таким образом, данная работа раскрывает ключевую роль полимеров в формировании пролиферирующих бактериальных колоний и предоставляет количественные принципы для более широкого прогнозирования и контроля этой морфодинамики.
Результаты исследования
Изображение №1
Была использована конфокальная микроскопия для прямой визуализации неподвижных бактерий, конститутивно экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP от green fluorescent protein) в своей цитоплазме, по мере их размножения в богатых питательными веществами растворах с полимерами, добавленными в определенной массовой концентрации (c). Для начала использовалась Escherichia coli в качестве модельной бактерии и слизь, полученная из первичных клеток поперечной ободочной кишки человека, в качестве полимерного раствора. В растворе без полимеров клетки непрерывно растут, делятся, отделяются друг от друга и термически диффундируют друг от друга, в конечном итоге образуя случайную дисперсию (1A и видео №1).
Морфогенез колоний совершенно другой в растворе слизи: клетки упаковываются бок о бок до ограниченного размера пучка, а затем остаются ориентированными конец к концу для последующих делений, в конечном итоге образуя переплетенную сеть длинных, змеевидных, многоклеточных кабелей (1B и видео №2). Это явление не зависит от источника слизи: наблюдалась схожая морфология колоний при использовании очищенного нативного свиного кишечного муцина (Muc2) при c = 0.5% м/о (видео №3), который также является репрезентативным для человеческой кишечной слизи.
Чтобы исследовать общность формирования кабелей, ученые повторили этот эксперимент, но заменили муцины, которые, как известно, адсорбируются на бактериальных клетках, на 100-кДа полиэтиленоксид (PEO от polyethylene oxide), химически инертный, незаряженный, неадсорбирующий синтетический полимер. Для достаточно концентрированных растворов PEO снова наблюдалось формирование кабелей (1C и видео №4). Это указывает на то, что формирование кабелей не требует специфических биохимических взаимодействий с муцинами.
Трехмерная реконструкция конечной колонии показана на 1D, иллюстрируя, что поперечное сечение каждого кабеля имеет несколько клеток, упакованных бок о бок, все нематически выровненные вдоль их длинной оси. Эта сеть кабелей простирается вглубь образца от твердых границ, и аналогичные морфологии кабелей возникают для непрерывно вращающихся образцов, в которых клетки не оседают, а остаются в объеме. Это указывает на то, что образование кабелей не сильно зависит от наличия границ в экспериментах.
Для дальнейшей проверки общности образования кабелей эксперимент вновь был повторен, но с применением еще более широкого диапазона различных полимеров: PEO трех различных молекулярных масс; фиколл, высокоразветвленный, незаряженный полисахарид; и натрийкарбоксиметилцеллюлоза (NaCMC), линейный, анионный полисахарид.
Во всех случаях наблюдалось образование кабелей, когда полимерный раствор достаточно концентрирован (1E и 1F; видео №5 и видео №6). Таким образом, образование кабелей возникает независимо от изменений в химии полимера, молекулярной массе, молекулярной архитектуре и заряде.
Изображение №2
В качестве окончательной проверки общности этого явления был проведен еще один опыт с использованием неподвижных штаммов двух других видов бактерий, которые также обитают в полимерных средах: Vibrio cholerae, кишечного патогена, и Pseudomonas aeruginosa, легочного патогена. И снова наблюдалось образование кабелей в обоих случаях (снимки выше). Это указывает на то, что это явление возникает в разных типах клеток. В совокупности эти результаты показывают, что неподвижные бактериальные колонии, размножающиеся в достаточно концентрированных растворах полимеров, обычно образуют крупные, извилистые, многоклеточные кабели.
Остается вопрос — почему образуются кабели? Учитывая, что образование кабелей не требует специфических биохимических взаимодействий, ученые предположили, что вместо этого оно возникает из-за какого-то другого физико-химического влияния полимеров на клетки. Например, может ли быть так, что когда полимеры достаточно концентрированы, они образуют сетчатую сеть, которая захватывает отдельные клетки, удерживая их в конфигурации конец к концу после деления и тем самым способствуя образованию кабелей? Данные опытов показывают, что это не так: во всех различных испытанных условиях не было найдено корреляции между пороговой концентрацией полимера, при которой начинают формироваться кабели, и c∗, концентрацией, при которой различные молекулы полимера начинают перекрываться и образовывать взаимосвязанную сеть. Аналогичным образом не было корреляции между началом образования кабелей и вязкостью раствора (η). Это указывает на то, что образование кабелей происходит не только из-за сниженной способности клеток диффузионно разделяться друг от друга после деления в вязком полимерном растворе.
Другая теория заключается в том, что осмотическое давление Πosm, оказываемое полимерами, изменяет то, как растут отдельные клетки, каким-то образом заставляя их размножаться в кабелях. Однако, образование кабелей происходит при осмотическом давлении всего лишь около десятков паскалей — намного ниже давления, при котором обычно изменяется физиология бактерий (∼100 кПа), что говорит против этой теории. Кривые роста, измеренные для встряхиваемых культур, не показывают заметных различий при добавлении полимера. Более того, осмотическое давление, при котором начинают формироваться кабели, различается в зависимости от разных полимеров, что указывает на то, что не только осмотическое давление контролирует формирование кабелей.
Изображение №3
Однако осмотическое давление полимерного раствора может влиять на пролиферирующие клетки другим способом: вызывая притягивающие взаимодействия между ними. Рассмотрим две микромасштабные частицы — например, соседние клетки (зеленые на 3A) — в полимерном растворе (розовый). Центры окружающих полимерных цепей исключены из небольшой области, окружающей каждую частицу (светло-серая), называемой ее исключенным объемом. Когда частицы находятся достаточно близко друг к другу, их исключенные объемы перекрываются, и окружающие полимеры истощаются из этой перекрывающейся области объема Vev (темно-серый). Это истощение полимеров приводит к возникновению разницы осмотического давления Πosm между частицами, сталкивая их вместе, как схематически показано на 3A(i). В коллоидной науке хорошо документировано, что этот энтропийный эффект заставляет пассивные, непролиферирующие частицы слипаться и может быть смоделирован как притягивающее «истощающее» взаимодействие между парами частиц. Величина этой энергии взаимодействия истощения равна Udep = ΠosmVev, где Πosm определяется размером и концентрацией полимера, а Vev тоже определяется размером и концентрацией полимера, а также размерами, формой и ориентацией частиц.
Может ли это вызванное полимером истощение притяжения между клетками каким-то образом заставить их размножаться в кабелях? Один из способов проверить эту идею — изучить обратимость формирования кабеля: учитывая энтропийную природу притяжения истощения, ожидается, что после того, как кабель сформировался, удаление полимера из раствора вокруг него должно позволить кабелю распасться посредством случайного теплового движения клеток. Именно это наблюдалось при промывке суспензии кабелей жидкостью без полимера (3B и 3C; видео №7).
Поддержка идеи притяжения истощения также исходит из тщательного изучения начальной динамики формирования кабеля (видео №8). Как показано на видео выше, начальная клетка-«основатель» растет и делится, давая начало паре клеток, ориентированных конец к концу. Затем, вместо того, чтобы термически диффундировать друг от друга, клетки быстро сцепляются бок о бок. Это предпочтение изначальному расположению бок о бок, а не конец к концу, напрямую предсказывается физикой взаимодействия истощения: перекрывающийся исключенный объем Vev и, следовательно, величина потенциала истощения Udep больше для пары клеток, когда они расположены бок о бок, а не конец к концу, как схематически показано на 3A(ii). Таким образом, при отсутствии других ограничений, в масштабах времени, более коротких, чем время клеточного удвоения td, вызванное полимером взаимодействие истощения заставляет пары клеток предпочтительно упаковываться бок о бок.
В качестве более прямой проверки этого предсказания ученые культивировали клетки в полимерном растворе без питательных веществ, в котором пролиферация останавливается (td → ∞). В этих условиях клетки действительно агрегируют бок о бок, что согласуется с предыдущими наблюдениями, образуя гексагонально упорядоченные кластеры (3D). В целом эти наблюдения устанавливают, что притяжение истощения, вызванное полимерами, играет ключевую роль в формировании кабелей. Однако после того, как исходная пара клеток упаковывается бок о бок, последующие деления обычно приводят к устойчивой конфигурации конец к концу, что приводит к росту кабелей.
Какие биофизические характеристики пролиферации в полимерном растворе являются существенными для формирования кабеля? Ответ на этот вопрос был найден с помощью двумерного агентного моделирования броуновской динамики. Каждое моделирование начинается с разбавленной дисперсии клеток, как и в экспериментах, которые пролиферируют в полимерном растворе с заданным размером полимера, вязкостью и осмотическим давлением. Моделирование включает четыре ключевые характеристики, схематически представленные на 4A:
- Отдельные клетки непрерывно удлиняются экспоненциально, разделяясь на два потомства после удвоения времени td.
- Соседние клетки имеют короткодействующее упругое отталкивание, которое отталкивает их друг от друга и не дает им перекрываться.
- Клетки подвергаются термическому перемешиванию и подвергаются как поступательной, так и вращательной диффузии в вязком полимерном растворе с соответствующими коэффициентами диффузии, которые определяются вязкостью полимерного раствора и размером/формой клеток.
- Клетки подвергаются притяжению истощения, вызванному полимером, которое задается потенциалом парного взаимодействия величиной Udep = ΠosmVev, где Πosm — характеристика полимерного раствора, подлежащего тестированию, а Vev задается размером полимера, а также размерами и ориентацией клеток.
Затем каждое моделирование можно параметризовать двумя безразмерными величинами: trot/td, которая сравнивает характерную шкалу времени вращательной диффузии клеток со временем их удвоения, и Uee/kBT, которая сравнивает величину потенциала истощения для клеток, расположенных в исходной конфигурации «конец к концу» после удвоения (3A(ii)), с характерной тепловой энергией kBT, где kB — постоянная Больцмана, а T — температура.
Примечательно, что этих четырех ключевых биофизических характеристик достаточно, чтобы повторить экспериментальные наблюдения. Пример показан на 4B. При отсутствии взаимодействия истощения (Uee = 0 kBT, верхний ряд) клетки непрерывно растут, делятся, разделяются и термически диффундируют, образуя случайную дисперсию, как в экспериментах (видео №9 и 1A).
Напротив, когда включается взаимодействие истощения, вызванное полимером (Uee = 15.55 kBT, нижний ряд), клетки быстро фиксируются бок о бок, а затем продолжают размножаться конец к концу, образуя большой многоклеточный кабель, как в экспериментах (видео №10 и 1B–1E). Хотя изначально кабели имеют ширину в две клетки, боковые слияния между отдельными кабелями (видео №2 и видео №4) или различными сегментами одного и того же кабеля (видео №6 и видео №10) могут образовывать еще более толстые кабели в течение длительного времени.
Изображение №5
Продемонстрировав, что моделирование может воспроизводить формирование кабелей, оно было использовано для решения вопроса: почему именно вызванное полимером истощение притяжения заставляет клетки размножаться в кабелях? Тщательное изучение начальной стадии формирования кабелей дает подсказку: как показано на начальных кадрах 4B (внизу) и на видео №10, кабель вырастает из исходного кластера из четырех клеток, причем две изначально расположены в энергетически предпочтительной конфигурации бок о бок, но их потомство сохраняется в конфигурации конец к концу с переплетением — как показано на крайних левых вставках на 5A. Ученые назвали эту конфигурацию «протокабелем». Учитывая, что наиболее энергетически выгодной конфигурацией для всех клеток является упаковка бок о бок, ученые предположили, что этот переплетенный протокабель «конец к концу» представляет собой метастабильное состояние, поддерживаемое силой истощающего взаимодействия, которое удерживает клетки кинетически запертыми в кабеле.
Моделирование четырех непролиферирующих клеток, изначально расположенных как конец к концу, так и бок о бок, как показано на 5B(i) и 5C(i), подтверждает эту гипотезу. Клетки быстро фиксируются в конфигурации протокабеля с переплетенными концами, показанной на 5B(ii) и 5C(ii). Затем, если взаимодействие истощения сильное (Uee = 3.88 kBT, красная кривая на 5A), клетки остаются в ловушке в этой конфигурации в течение всего периода удвоения td — в конечном итоге позволяя им пролиферировать в кабель. Однако, когда взаимодействие истощения слабее (Uee = 0.97 kBT), термодиффузия позволяет клеткам в конечном итоге перестроиться в наиболее энергетически выгодную конфигурацию бок о бок, прежде чем они удвоятся, как показано резким провалом на синей кривой. Эти наблюдения предполагают, что конфигурация конца к концу с переплетенными концами действительно является метастабильным состоянием.
Картирование полного ландшафта потенциала, зависящего от ориентации, обусловленного взаимодействием истощения (величина Udep), обозначенного цветами на 5B, подтверждает это предположение. Как и ожидалось, расположение всех четырех клеток бок о бок является наиболее энергетически выгодным состоянием, отраженным глобальным минимумом в ландшафте свободной энергии (самая левая звезда). Однако, конфигурация протокабельного соединения «конец к концу» является локальным минимумом в этом ландшафте свободной энергии (самая правая звезда). Построение контура минимальной энергии, который простирается через этот ландшафт (5C), еще более четко выявляет этот локальный минимум глубиной ≈1.6 Uee.
Таким образом, возникает ясная картина биофизических правил, лежащих в основе формирования кабеля: после того, как пара клеток, расположенных бок о бок, делится конец к концу, как показано на 5C(i), они остаются кинетически захваченными в метастабильной конфигурации протокабельного соединения конец к концу (5C(ii)) в течение приблизительного времени выхода tesc, которое определяется размером и формой клетки, а также размером полимера, концентрацией, осмотическим давлением и вязкостью. Если tesc > td, клетки продолжают размножаться в этой конфигурации, в конечном итоге образуя кабель. Однако, если tesc < td, тепловая энергия позволяет клеткам выходить из этой кинетической ловушки и продолжать формировать другие конфигурации (5C(iii), 5C(iv)), и они не образуют кабели. Эта биофизическая картина объединяет все экспериментальные наблюдения, демонстрируя, что образование кабеля возникает для различных типов клеток и в различных полимерных растворах, когда они достаточно концентрированы, обратимым образом.
Изображение №6
В качестве окончательного количественного теста этой картины ученые напрямую вычислили tesc для различных полимерных растворов. В частности, были использованы результаты моделирования для оценки глубины и кривизны локального минимума в ландшафте свободной энергии, что соответствует конфигурации протокабельного соединения «конец к концу», вдоль контура минимальной энергии, показанного на 5C. Затем ученые использовали работу Крамерса по термически активированному выходу из потенциальной ямы, чтобы напрямую связать эти величины, которые зависят от свойств клетки и полимера со временем выхода. Граница, соответствующая tesc = td, которая разделяет два различных режима, задана сплошной черной кривой на 6A.
Этот график представляет собой морфологическую диаграмму состояний, охватываемую двумя безразмерными контрольными параметрами, выявленными анализом, trot / td и Uee / kBT; справа от черной границы ожидается, что клетки размножаются в кабели (красные панели на 6B), тогда как слева от нее они этого не делают (синие панели). Также ожидается переходный режим сразу слева от черной границы, для которого tesc < td и клетки не кинетически захвачены в конфигурации конец к концу, поскольку они удваиваются, но Uee > kBT, заставляя клетки по-прежнему располагаться бок о бок в небольших агрегатах (светло-голубой). Формирование кабелей конкурирует с агрегацией, когда начальный инокулят клеток достаточно сконцентрирован. Как суммировано треугольниками (эксперименты) и кругами (моделирование) на 6A, с репрезентативной морфологией колоний, показанной на 6B, данные полностью подтверждают эти ожидания. Таким образом, в совокупности эксперименты, моделирование и теоретический анализ устанавливают биофизические принципы, описывающие, как бактериальные колонии размножаются в полимерных растворах — в различных типах клеток и полимерах, как природных, так и синтетических.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
В рассмотренном нами сегодня труде ученые решили детально изучить поведение бактерий, живущих в полимерных средах, таких как слизь. Это открытие может быть особенно важным для изучения и лечения таких заболеваний, как кистозный фиброз, при котором слизь, выстилающая легкие, становится более концентрированной, что часто приводит к тому, что бактериальные инфекции, которые проникают в эту слизь, становятся опасными для жизни. Это открытие также может иметь значение для исследований полимер-секретирующих конгломератов бактерий, известных как биопленки.
Ученые установили, что когда многие бактерии растут в жидкостях, содержащих полимеры, например, слизь в легких, они образуют структуры, похожие на кабели, которые переплетаются. Любопытно то, что между физикой поведения этих кабелей и неживых гелей оказалось много общего.
Частым явлением в природе является потеря бактерией способности плавать. Обычно такая клетка делиться на две, которые клетки разделяются и диффундируют друг от друга. Но в полимерном растворе эти клетки остаются приклеенными друг к другу в конфигурации конец к концу. Клетки продолжают делиться, тем самым формируя длинные кабели, которые затем изгибаются и скручиваются в запутанную сеть. Данный процесс формирования кабеля будет длиться до тех пор, пока клетки получают питательные вещества, в результате чего формируются кабели длинной в тысячи клеток.
Эксперименты также показали, что на этот процесс не влияют вид бактерий и тип полимера. Как оказалось, важным фактором, влияющим на формирование кабелей, является внешнее давление, оказываемое полимером, окружающим клетки.
Как отмечают ученые, изначальной целью исследования было лучше понять рост инфекций у пациентов с муковисцидозом, но это не единственное применение полученных знаний. Слизь играет важную роль в организме человека, не только в легких, но и в кишечнике и в цервико-вагинальном тракте. Авторы исследования утверждают, что работа также важна в контексте биопленок, групп бактерий, которые выращивают собственную инкапсулирующую полимерную матрицу. Биопленки есть в организме человека, например, зубной налет, но они также чрезвычайно распространены в почве и в промышленных условиях, где они могут повредить оборудование и представлять опасность для здоровья.
Что дает бактериям формирование кабелей — этот вопрос пока без ответа, однако ученые имеют некие предположения. Возможно, бактерии слипаются и формируют данную сеть живого геля, пытаясь стать больше и, следовательно, более устойчивее к поглощению и уничтожению иммунными клетками. С другой стороны, эффект может быть противоположным: слизь не статична (например, в легких она постоянно подхватывается маленькими волосками на поверхности легких и продвигается вверх), а потому, возможно, что в конечном итоге бактерии, слипающиеся в кабели, лучше выводятся из организма. Полученные в данном исследовании знания позволяют продолжить работу и найти ответы на эти вопросы.
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
