«Московский клуб покупателей» терапии от старения — план исследований

                                            Активисты борьбы со СПИДом в 1980-х

По итогам моего предыдущего поста некоторые читатели упрекнули меня в том, что я описал в нем не план, а лишь гипотезу. Хотя там было и то, и другое. Просто план был в общих чертах, с высоты птичьего полёта. А гипотеза очень простая: эпигенетический откат есть эпигенетическое омоложение. Следовательно, откатывая любым образом профиль метилирования генов, мы откатываем и биологический возраст организма, а значит, омолаживаем его.

Если кому-то интересен подробный план предлагаемых мною исследований, я изложу его ниже. Но прежде хочу ответить на другое услышанное мной возражение: «А не проще ли подождать Бельмонте?» Оно-то, конечно, проще. Сидеть и ждать пока другие решат все твои проблемы действительно проще. Но когда речь идёт о смертельном заболевании, это не лучшая стратегия.

Если бы ВИЧ-инфицированные в 80-х молча сидели и ждали, думаю, гораздо меньший процент из них дожил бы до спасительных антиретровирусных коктейлей. Они это отлично понимали, и поэтому организовывали многотысячные демонстрации, требуя найти средство от ВИЧ как можно скорее, а также создавали «Даласские клубы покупателей» для того чтобы пробовать различные экспериментальные терапии на себе.

Я считаю, что к ВИЧ 2.0 нужно относиться точно так же. Делать всё возможное для скорейшей разработки хоть какой-то мало-мальски эффективной терапии. Потому что иначе наши родители до такой терапии не доживут.
И я не уверен, что Бельмонте одержим этой идеей настолько же, насколько одержим ей я. Но даже если он тоже активно продолжает исследования в этой области, нет ничего плохого в том, чтобы этим занималось несколько команд. В любом случае Бельмонте в первую очередь учёный. А я — практик. Мне важен только конечный результат в виде продлевающей жизнь терапии, и даже её коммерческая ценность для меня вторична. Хотя если всё получится, уверен, что коммерческий успех тоже придёт. Но деньги — не самоцель, они лишь инструмент для достижения куда более важной цели.

Собственно, план исследований

Сначала немного матери учения. Итак, ключевая гипотеза: чтобы достоверно омолодить весь организм, нам нужно откатить эпигенетические часы большинства клеток организма, если вообще не каждой клетки. Благодаря работе группы Бельмонте мы знаем, что это возможно путём доставки факторов OSKM (или других факторов транскрипции) в клетку. При этом процесс подвержен «проблеме Златовласки»: откатив слишком слабо, мы не получим значительного омолаживающего эффекта; откатив слишком сильно, можно получить рак, поскольку клетки потеряют свой фенотип и вернутся в стволовое, плюрипотентное состояние.

Не стоит забывать, что именно способность эффективно возвращать клетки обратно в плюрипотентное состояние и послужила основным критерием отбора для выбора Яманакой 4 факторов OSKM из исходных 24 кандидатов. Поэтому хотя факторы OSKM и показали свою эффективность для омоложения путем частичного отката и представляют собой «синицу в руке», они далеко не идеальны для целей безопасного омоложения. А значит, стоит продолжить поиск более безопасных способов эпигенетического отката. Имеет смысл начать с проверки оставшихся 20 факторов из исходных 24 факторов Яманаки, а также попробовать использовать один только фактор Oct4, так как есть данные что он единолично способен откатывать эпигенетику и вообще является главным «стражем эпигенетических ворот».

Также стоит проверить и другие методы перепрограммирования, разработанные за последние годы. Например, посмотреть на метод замены факторов транскрипции Oct4, Sox2, c-Myc антителами, который опубликовали буквально на этой неделе. Если этот подход сработает, то генные манипуляции могут вообще оказаться не нужны, а достаточно будет периодического введения антител. Хотя при многократном введении могут возникнуть проблемы со вторичным иммунным ответом.

В любом случае пока для меня основная гипотеза терапии — генная, с помощью неких факторов отката. Но найти лучшие факторы — лишь полдела. Другая половина — как доставить их в организм безопасно и, в идеале, дешево. Эпигенетическая программа старения довольно упряма даже перед лицом еженедельных откатов, как показала работа группы Бельмонте. Поэтому чтобы добиться значимого омоложения у людей, скорее всего, придется ежемесячно или даже еженедельно активировать факторы отката.

Наиболее экономичным способом для этого мне видится интеграция специальной, по умолчанию неактивной генной кассеты (содержащей гены факторов отката) в практически каждую клетку пациента, предположительно с помощью лентивирусов или другого интегративного метода доставки. Далее такая кассета должна будет периодически активироваться уникальным и инертным агентом, который может быть разработан отдельно и сделает такую терапию патентоспособной. Сегодня такие кассеты активируются, например, тетрациклином или доксициклином. При таком подходе стоимость еженедельной индукции омолаживающих факторов будет обусловлена лишь стоимостью индукционного агента (предположительно, малой молекулы или пептида) — то есть, будет сравнительно дешевой.

Оптимальным планом мне видится пошаговое, итерационное улучшение уже доказанного подхода (индукция факторов OSKM с помощью доксициклина; такая кассета с факторами OSKM может быть доставлена в организм используя лентивирусный носитель, доступный на рынке уже сегодня) и параллельная разработка идеальной терапии (максимально безопасные и эффективные факторы, активируемые уникальным, инертным, патентоспособным агентом).

Таким образом, исследования можно разделить на три параллельных трека:

• разработать оптимальный режим дозирования, используя 4 исходных фактора OSKM
• найти более безопасные (не приводящие к полной де-дифференциации) факторы или способы эпигенетического отката
• создать наилучшее средство доставки генов (желательно патентоспособное)

Далее я более подробно опишу все три направления исследований.

Исследовательский трек 1 («синица в руке»): разработать оптимальный режим дозирования, используя 4 исходных фактора OSKM

Группа Бельмонте установила, что мыши начинают умирать после 3-х последовательных дней индукции OSKM:

Поэтому они использовали протокол 2/5, в котором мыши (с только 1-ой копией аллели с кассетой OSKM — это важно, так как у мышей с 2-мя копиями образовывались тератомы) 2 дня подряд подвергались индукции OSKM (с помощью доксициклина), а затем получали 5-дневный перерыв перед повторением цикла лечения.

Однако вес мышей начинал снижаться уже со 2-го дня индукции:

Это наводит на мысль, что двухдневная последовательная индукция не является оптимальной. Более того, 5-дневный перерыв мне кажется слишком длинным, основываясь на том, что я знаю о клеточных циклах. Думаю, режим лечения 1/2 или 1/3 имеет лучший долгосрочный потенциал (1-дневная индукция, и 2- или 3-дневный перерыв).

Чтобы проверить эти предположения, необходимы следующие шаги (эти исследования лучше всего заказывать у крупных CRO, например, у Charles River):

• Купить в Jackson Laboratories мышей дикого типа с генной кассетой OSKM, желательно в возрасте 12 мес.
• Идеальным было бы 30 контрольных мышей + 20 групп по 12 мышей в каждой для разных доз / режимов
• Запустить все группы параллельно
• Периодически забирать кровь, слюну и мочу у некоторых мышей из каждой группы чтобы отслеживать изменения профиля метилирования, особенно до и после индукции факторов OSKM — чтобы убедиться, что действительно происходит эпигенетическое омоложение
• Некоторые группы подвергнуть когнитивным и физическим тестам, чтобы проверить гипотезу, что мыши в группах терапии обладают более низким биологическим возрастом, и установить наилучший режим дозирования, не дожидаясь полной смертности во всех группах (так как одни только контрольные мыши живут 2,5 года, а при успехе терапии этот показатель может существенно увеличиться для экспериментальных групп)
• Для проекта по ГМО домашним животным вывести несколько трансгенных пород собак и кошек с кассетой OSKM и протестировать различные режимы индукции этих генов, собирая те же данные, что и на мышах

Исследовательский трек 2 («журавли в небе»): поиск более безопасных факторов эпигенетического отката (не приводящих к полной де-дифференциации)

• Начать с исследований только фактора Oct4 in vitro измеряя эпигенетические изменения (используя часы метилирования Hannum/Horvath) — так как есть данные, что достаточно только этого фактора транскрипции для эпигенетического омоложения
• В идеале исследовать каждый из 24-х исходных факторов Яманаки in vitro измеряя эпигенетические изменения (используя те же самые часы метилирования Hannum/Horvath)
• Затем изучить каждую комбинацию идентифицированных факторов на быстро стареющих LAKI мышах путем создания нового трансгенного штамма для каждой комбинации с использованием доксициклиновой кассеты
• Изучить безопасность этих факторов, используя последовательную ежедневную активацию (как в работе Бельмонте с OSKM). Цель — найти лучшую выживаемость, чем показали факторы OSKM (от которых мыши начинали умирать после 3-х последовательных дней индукции)
• Далее для наиболее безопасных факторов протестировать новые режимы дозирования на LAKI мышах с целью продлить им жизнь более чем на 50%
• Параллельный проект: использовать антитела вместо факторов Oct4, Sox2, c-Myc как в этой работе. Если этот подход сработает, то генные манипуляции вообще будут не нужны. Достаточно будет введения антител. Начать с LAKI мышей, проверить и на WT мышах с прицелом на изменения часов метилирования (будет ли биовозраст снижаться не хуже чем от OSKM?)
• Параллельный проект: исследовать роль белков Piwi и Piwi-interacting RNAs как факторов подавления транспозонов и потенциального эпигенетического омоложения, как в этой статье.
• Параллельный проект: исследовать варианты гистонов TH2A и TH2B, которые, согласно этой работе, могут заменить Sox2 и c-Myc, а значит сами по себе могут индуцировать эпигенетический откат.

Исследовательский трек 3: средство доставки (носитель) и патентоспособность

• ААВ и лентивирусы с кассетой OSKM можно купить сейчас. Необходимо взять LAKI и WT взрослых мышей и провести серию экспериментов по (а) эффективности доставки этих генов во взрослый организм, и (б) эффекта на часы метилирования и биологические параметры от их индукции. Будут ли такие мыши жить дольше, даже если гены OSKM попадут далеко не во все клетки? Необходимо будет заказать и такие исследования.
• Для интегративных (то есть с интеграцией новых генов в ДНК) подходов основным препятствием для использования у взрослых животных является низкая степень интеграции (10–50% для AAV или лентивирусных векторов), а также низкая проницаемость гематоэнцефалического барьера (а нам, скорее всего, критически важно омолаживать гипоталамус). Таким образом, это должно быть одной из основных областей исследований. Нужно протестировать последовательную многократную трансфекцию — можно ли таким образом добиться доставки нужных генов хотя бы в 75% клеток во всех тканях? Нужен алгоритм защиты от многократной индукции в одной и той же клетке — если в неё попало несколько кассет с генами, мы совсем не хотим, чтобы индуцировались они все.
• Другие методы доставки: доставка белков или мРНК (неинтегративная, но дорогостоящая). Заказать исследования у компаний, занимающихся разработкой методов доставки генов. Например, у Scarab Genomics.
• Ещё один метод: освобожденный антителом релиз ДНК (новый, экспериментальный, дорогой метод). Необходимо будет проконсультироваться с его разработчиками.
• Чтобы максимизировать шансы заинтересовать этой терапией Большую Фарму — без которой невозможно будет провести клинические исследования стоимостью в сотни миллионов долларов, — нужно стремиться не только к безопасному и эффективному, но и к патентоспособному подходу: в идеале, это должна быть кассета с уникальной комбинацией факторов, активируемых безопасным, инертным и запатентованным активатором (в отличие от доксициклина). Сама кассета (оболочка+индуктор) может быть разработана как своими силами, так и куплена (лицензирована), как только станут доступны такие системы доставки.

Цены, сроки

Вот что у меня получилось по ценам и срокам:

• Исследовательский трек 1 (факторы OSKM на мышах): 1,5–2 млн долларов США; срок: 3 года
• Исследовательский трек 1 (домашние животные): 3–4 млн долларов США; срок: 2 года
• Исследовательский трек 2 (лучшие факторы): 6–8 млн долларов США; срок: 4–5 лет
• Исследовательский трек 3 (средство доставки): 2–3 млн долларов США; срок: 2–3 года
• Безопасность: 3–5 млн долларов США; срок: 2–3 года
• Исследование на приматах (факультативно): 2–2,5 млн долларов США; срок: 1–2 года
• Зарплаты / Накладные расходы / Патентные / Юридические и другие расходы: 1,5–2 млн долларов США в год

Основные майлстоны проекта:

• 2 года до вывода на рынок ГМО домашних животных с генами OSKM, индуцируемыми доксициклином
• 3–4 года до минимальной терапии для взрослых домашних животных (лентивирус с OSKM или другими факторами)
• 5–6 лет до начала испытаний минимальной терапии на людях (стадия подачи заявки IND в FDA)

Срок проекта в 5–6 лет означает накладные расходы в размере 7,5–12 млн долларов США, исходя из вышеуказанных 1,5–2 млн долларов США в год. Таким образом, общая сумма расходов до этапа IND составляет: 24–37,5 млн долларов США.

Если проект успешно достигнет этапа IND, далее его с руками и ногами оторвут компании Биг Фармы, которые затем начнут клинические исследования такой терапии (сначала от атеросклероза, болезни Альцгеймера, диабета или других возрастозависимых нозологий, по которым сегодня приходится тестировать препараты для замедления старения, так как само старение ещё не классифицировано ВОЗ как заболевание).

Резюме

Такой вот проект «Московского клуба покупателей» выкристаллизовался у меня в голове. Или даже «клуба самоспасателей». Посмотрим, что из этого получится. Если удастся найти для него финансирование, думаю, это будет славная охота. Надеюсь, по её итогам ВИЧ 2.0 понесёт существенные потери, и мы сможем отвоевать у неё хотя бы несколько десятилетий здоровой жизни для нас и наших близких.