Многие организмы за время своего существования претерпевают ряд изменений, физиологических, биохимических, структурных и т.д. В зависимости от вида изменения могут быть как незначительными, так и радикальными. Говоря о последних, в первую очередь вспоминаются чешуекрылые, которые в начале своего жизненного цикла разительно отличаются от того, чем они становятся после метаморфоз, происходящих внутри кокона. Тот факт, что гусеница и бабочка являются стадиями развития одного организма был открыт не сразу, что вполне простительно, учитывая разницу внешнего вида и повадок. Когда гусеница превращается в бабочку, она обзаводится тем, что меняет способ ее передвижения, а именно крыльями. Состоящие из многочисленных чешуек, сложенных как невероятно деликатная мозаика, крылья бабочек считаются одними из самых удивительных структур на планете. Как они выглядят и функционируют, мы знаем. Но как они формируются внутри кокона? Узнать это решили ученые из Массачусетского технологического института (США). Им удалось заглянуть внутрь кокона и детально рассмотреть образование крыльев в процессе метаморфоза бабочки вида Vanessa cardui (сонцевик будяковий). Данное исследование уже затрагивалось на хабре, но мы, как гласит традиция, копнем глубже. Поехали.
Основа исследования
Доводилось ли вам держать в руках бабочку. Вполне вероятно, что да, если вы в детстве хоть раз бывали летом у бабушки или просто где-то на природе. Первое, что замечаешь, это хрупкость крыльев этого удивительного насекомого. Малейшее прикосновение к крыльям и у вас на пальцах остается какая-то пыльца. Но это не пыльца, собранная бабочками из цветов, хоть они и являются опылителями для многих растений. На самом деле это те самые чешуйки, из которых состоят их крылья.
Помимо очевидной функции полета, крылья могут выполнять и другие важные задачи, если их структура это позволяет. Ранее мы уже рассматривали (Акустическая обманка мотыльков: спастись ценою крыльев), как мотыльки способны уходить от преследования летучих мышей посредством акустических обманок, являющихся специальными отростками на нижних концах крыльев.
Бабочка вида Aglais io (павлиний глаз) и ее крыло под микроскопом.
Функциональные структуры чешуек крыльев бабочки формируются во время развития куколки: на чешуйчатых клетках вырастают выступы, которые служат в качестве каркаса для наноразмерных кутикулярных морфологий.
Различная морфология чешуек наделяет бабочек уникальным внешним видом, обеспечивает терморегуляцию и водоотталкивающие свойства, генерирует акустические и аэродинамические эффекты. Все эти функции работают только потому, что наноразмерные чешуйки расположенны именно так, как нужно. Другими словами, крылья бабочек напоминают сложный музыкальный инструмент, для идеального звучания которого нужна точная настройка.
Каждая чешуйка на крыле бабочки образована отдельной клеткой, которая выделяет хитиновую кутикулу, образующую одноклеточный экзоскелет. У многих бабочек морфология крыльев образована рядами чередующихся нижних и верхних чешуек (т.е. тех, что лежат в основе, и тем, что их покрывают сверху).
Созревшая чешуйка бабочки вида Vanessa cardui представляет собой образец скелетной чешуйки, которая широко встречается как в простой, так и в сложной морфологии крыла у чешуекрылых (1A—1D).
Изображение №1
Как правило, верхняя поверхность чешуйки состоит из выступов, спускающихся по ее длине. Эти гребни состоят из перекрывающихся пластин и соединены поперечными ребрами.
Поддерживающие трабекулы соединяют верхние элементы и нижнюю поверхность чешуек, которая по существу представляет собой тонкую пластинку толщиной порядка 100 нм.
Ученые отмечают, что важным этапом в понимании этих сложных структур стал анализ рассеченных и окрашенных тканей крыла в дискретные моменты времени их развития. В 1938 году была задокументирована последовательность клеточного деления, выпячивания чешуек, роста и образования гребней у Ephestia kuehniella (мельничная огнёвка). С того времени микроскопия стала неотъемлемым инструментом в изучении наноразмерных структур в тканях крыла бабочки. Было проведено немало опытов и наблюдений, связанных с описанием крыльев на разных этапах развития бабочки.
Однако, эти изыскания базировались на данных, взятых в определенный момент времени, как фото. Ученые из МТИ же, если продолжать аналогию, решили сделать полноценное видео.
В рассматриваемом нами сегодня труде они предложили метод визуализации развивающихся чешуйчатых клеток у живой бабочки V. cardui с использованием спекл-корреляционной фазовой отражательной микроскопии (speckle-correlation reflection phase microscopy). Этот метод количественной фазовой визуализации позволяет наблюдать за ростом клеток in vivo (т.е. в живот организме) с высоким временным и пространственным разрешением.
Результаты исследования
Изображение №2
Чтобы отобразить чешуйки крыльев бабочки во время метаморфоза, был разработан протокол подготовки образцов, который позволял получать количественные фазовые изображения in vivo.
Оптический доступ к ткани крыла во время развития был получен посредством замены части кутикулы куколки на стеклянное окно (2A и 2B).
Изначально крыло представляет собой полупрозрачный эпителиальный лист. Поскольку чешуйки образуют хитиновую кутикулу, крыло становится отражающим и в конечном итоге показывает зрелые пигментные узоры (2B—2E). Для длительных количественных наблюдений с высоким пространственным разрешением использовалась микроскопия (2F). Данная методика дает данные как по фазе, так и по амплитуде от живых и немаркированных образцов, с отличным осевым сечением, отклоняя расфокусированную информацию (2G—2I и видео №1).
Видео №1: сканирование объема фазовых и амплитудных данных куколки при 83% развития (соответствует 2G—2I).
Амплитудные данные фиксируют изменения показателя преломления, которые обычно связаны с интерфейсами материалов (2G). Путем сканирования по глубине ткани можно реконструировать трехмерное изображение живых, развивающихся чешуек и ткани крыла для объемов 75 х 75 х 200 мкм3 с максимальным латеральным разрешением 490 нм и максимальным осевым разрешением 1.03 мкм. Трехмерные объемные данные амплитуды были визуализированы путем цветового кодирования каждого среза данных в соответствии с его высотой в объеме изображения (2H и видео №2).
Видео №2: 3D-рендеринг амплитудных данных куколки при 83% развития (соответствует видео №1 и 2G—2I).
Фазовые данные фиксируют высоту интерфейса материалов внутри каждого оптического среза. Ориентация фазового градиента, который кодирует локальный наклон на поверхности чешуйки, выявляет критические особенности чешуйки (2I). Профили отдельных линий количественно определяют высоту поверхности чешуйки с точностью до ~ 10 нм, обеспечивая количественное понимание образования гребней и ламелей на протяжении всего метаморфоза (2J и 2K).
Изображение №3
В ходе наблюдений отслеживалось развитие отдельных особей от первых нескольких часов после окукливания до тех пор, пока организм не начнет вылупляться. Продолжительность стадии куколки (100% развитие) обычно составляет около 10 ± 2 дня, причем время развития чешуек зависит от ее типа и расположения на крыле. В ходе опытов ученые наблюдали за полным преобразованием ткани крыла из простого сложенного монослоя эпителия в зрелое крыло с полностью сформированными чешуйчатыми структурами (видео №3).
Видео №3: отображение роста чешуйки крыла бабочки Vanessa cardui.
Приблизительно на 1% развития морфологически гомогенные эпителиальные клетки плотно упакованы на поверхности крыла (3A). Они более редко внутренне связаны через развивающуюся сеть межклеточных соединений (видео №4).
Видео №4: визуализация эпителия молодого крыла Vanessa cardui.
Заметны митозы генерализованных эпидермальных клеток, расположенных в плоскости ткани. Затем выбранные клетки (клетки-предшественники чешуек) увеличиваются в размере (красные области на 3B). Эти клетки претерпевают два деления: после первого деления одна дочерняя клетка дегенерирует, в то время как другая продолжает второе деление с образованием чешуйчатой клетки и углубления. Клетка чешуйки выступает из углубления на поверхности крыла (3C).
Хоть мембрана выступа изначально и шероховатая (вероятно, из-за микроворсинок, которые лежат в основе образования эпикутикулы), поверхность вскоре становится гладкой. Затем чешуйка увеличивается (3D), в конечном итоге достигая своей окончательной длины и ширины на этапе 60% от полного развития куколки.
Когда чешуйка достигает своей окончательной длины, передняя кромка разделяется на несколько частей и появляется продольная структура гребней (3E). Гребни становятся более выраженными и образуют ламели, в то время как нижняя пластинка постепенно расширяется, покрывая все, кроме краев нижней поверхности (3F).
Отслеживая постепенные изменения в росте чешуек с течением времени, можно было точно определить время конкретных событий развития внутри отдельных куколок и начать выделять процессы, управляющие морфогенезом (3G). В данном исследовании ученые выделяют два основных аспекта развития чешуек:
- формирование пространственного паттерна клеток-предшественников чешуек в ткани крыла;
- эволюция расстояния между гребнями чешуек и их высота во время роста чешуек.
Как уже говорилось ранее, у V. cardui и других бабочек чешуйки расположены аккуратными рядами с чередованием верхних и нижних. Первый шаг в формировании этого паттерна был приписан латеральному ингибированию посредством сигнального пути NOTCH*.
Сигнальный путь NOTCH* — высококонсервативная клеточная сигнальная система, присутствующая у большинства животных. Млекопитающие обладают четырьмя разными NOTCH-рецепторами, называемыми NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 и NOTCH4. NOTCH-рецептор представляет собой однопроходный трансмембранный рецепторный белок.
Этот вывод основан на сравнении развития чешуек с развитием щетинок у Drosophila, где передача Notch-сигналов между соседними клетками создает петлю обратной связи, приводящую к пространственно изолированным клеткам с низким Notch, которые становятся клетками-предшественниками щетинок.
Сходным образом, в крыльях куколки молодых чешуекрылых, клетки с низкой экспрессией Notch наблюдались в виде неоднородных рядов. Как именно клетки-предшественники чешуек организовываются в конечный аккуратный ряд, пока неизвестно. Одна из гипотез предполагает наличие миграции и перестройки клеток.
Данные по V. cardui показывают, что подмножество эпителиальных клеток дифференцируется в неоднородные ряды больших изолированных клеток-предшественников (4A), что согласуется с предыдущими наблюдениями ранней морфологической дифференцировки. Хотя эти клетки-предшественники изначально выровнены в приблизительном порядке, впоследствии они смещаются в более выраженные ряды (4B и 4C), не касаясь друг друга.
Изображение №4
Затем меньшие клетки, которые расположены между клетками-предшественниками, также дифференцируются, вырастая до больших размеров, как у клеток-предшественников (4C и 4D; видео №5).
Видео №5: дифференциация второго набора клеток-предшественников чешуек (соответствует изображению №4).
Поскольку первый и второй наборы клеток-предшественников чередуются в заданном ряду, каждая группа должна давать начало верхним или нижним чешуйкам.
Следовательно, образование плотных рядов чешуек в первую очередь обеспечивается дифференцировкой второго набора клеток-предшественников чешуек, которые пространственно чередуются в соответствии с первым набором.
Изображение №5
Чтобы определить геометрические ограничения и сделать вывод о биомеханических процессах, которые влияют на морфологическое развитие чешуек, ученые отследили и количественно оценили эволюцию различных структурных параметров.
Относительно короткий промежуток времени, примерно от 35 до 40% развития (примерно на 100-114 час), содержит много ключевых моментов формирования чешуйки: чешуйки достигают максимального размера, образуются выпуклости на краях и появляются гребни (5A и 5B).
Длина и ширина чешуйки развиваются на разных временных шкалах, при этом длина немного сокращается еще до того, как чешуйка достигает своей конечной ширины (5C и 5D).
Во время большей части периода увеличения чешуек и без того тонкая чешуйка постепенно продолжает истончаться (5E). Тем не менее, несмотря на этот анизотропный рост, объем и площадь поверхности растут синхронно (5F).
Примерно на 39% развития куколки становятся видимыми длинные лонжероны, идущие по всей длине чешуек (5G). Поскольку фазовые данные показывают гладкую поверхность чешуек, когда эти особенности впервые появляются, они, вероятно, представляют собой пучки актина (глобулярный белок, образующий микрофиламенты), которые в конечном итоге будут формировать гребни.
По мере увеличения чешуйки расстояние между пучками актина также увеличивается, пока не достигает ~ 1.8 мкм. Вскоре после этого поверхность мембраны перестает быть гладкой, и становится трудно определить, являются ли продольные полосы актином, служащим в качестве шаблона для гребней, или самими гребнями.
Предыдущие исследования предполагает, что расстояние между пучками актина и расстояние между кутикулярными гребнями тесно связаны и, по-видимому, не изменяются от 40 до 95% развития. Детальный анализ этого интервала развития куколки подтвердил, что после того как поверхность чешуйки перестает быть гладкой, периодический интервал действительно остается постоянным на отдельных чешуйках на протяжении большей части развития гребня.
Данные наблюдений также показывают, что морфология поверхности изменяется в начале образования гребней (5H). Эпикутикула на поверхности чешуйки гладкая на протяжении большей части расширения чешуйки. Начало образования гребня, по-видимому, начинается ближе к концу расширения чешуек (~ 37% развития) после того, как она достигает своей максимальной длины, но до того, как она достигает своей полной ширины. Волнообразность гребней имеет неоднородный интервал и различное распределение по поверхности чешуйки. Затем, при развитии ~ 39%, периодичность становится очень регулярной и остается таковой по мере увеличения высоты возникающих гребней. Также данные говорят, что расстояние между гребнями остается почти постоянным с самых ранних моментов их появления и роста до поздних стадий развития, когда большая часть тонкой структуры гребней сформирована.
Ранее предполагалось, что гребни появляются между регулярно расположенными пучками актиновых филаментов, которые необходимы для правильного образования гребней. Но данные наблюдений показали, что расстояние между гребнями остается постоянным после их первоначального появления. Это означает, что уменьшение расстояния между актиновыми пучками маловероятно и, следовательно, не может управлять образованием гребней.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
Многие особенности животных, населяющих Землю, удивляли людей долгие годы и порождали не просто праздное любопытство, а попытки понять, как все устроено, чтобы это воспроизвести в механическом или электронном виде. Как собаки чуют даже самые слабые запахи, как альбатросы покоряют небеса, как бабочки могут летать со столь хрупкими крыльями. Эти и множество других вопросов всегда тревожили представителей науки.
В данном труде ученым удалось рассмотреть крылья бабочек во время их формирования в процессе метаморфозы внутри куколки. Сделав небольшое окно, заменив часть кокона стеклом, а также использовав микроскопию, ученые смогли детально описать все стадии развития крыла, в том числе и чешуек, его покрывающих.
Несмотря на большой объем новых данных, ученые честно заявляют, что вопросов касательно крыльев бабочек еще хватает. При этом они уверены, что их метод исследования, протекающий in vivo (т.е. на живом объекте) в реальном времени, при должном совершенствовании сможет в будущем раскрыть и другие тайны столь деликатной, но удивительной структуры.
Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! 🙂
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
