Современный мир полон проблем, многие из которых имеют глобальный характер. Одной из таких проблем является экология. Практически каждый день мы слышим ужасающую статистику загрязнения воздуха, почвы и воды, а также страстные тирады защитников экологии, обвиняющих всех и вся в экологической катастрофе. Отрицание вины человека, приложившего немало усилий для возвышения своего вида ценой всего вокруг, было бы глупо. Но обмен обвинениями на данном этапе не имеет практического смысла, ведь необходимо думать не о том, кто виноват, а о том, как это исправить. Кто-то скажет, что «починить» экологию уже нельзя, и это будет правдой, но это не значит, что нужно бездействовать. Ученые из Университета штата Северная Каролина (США) создали генетически модифицированную бактерию, способную расщеплять частицы ПЭТ в соленой воде. Это позволит на шаг приблизиться к решению проблемы микропластика в морях и океанах. Каким модификациям была подвержена бактерия, в чем их смысл, и насколько полученный организм эффективен в борьбе с пластиком? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.
Основа исследования
Подавляющее большинство (60%) пластиковых отходов в конечном итоге выбрасывается на свалку или накапливается в естественной среде, поскольку современные подходы к переработке приводят к образованию пластика с худшими физическими свойствами. Проще говоря, переработанный пластик обладает худшими свойствами, чем новый, потому стремление его использовать не особо заметно.
Учитывая тот факт, что период полураспада небиоразлагаемого пластика в окружающей среде составляет от 2.3 до более 2500 лет, в настоящее время в окружающей среде наблюдается накопление пластика. И если с большим (буквально) пластиком справиться проще, то малые размеры микропластика (менее 5 мм) вносят кучу дополнительных сложностей. Микропластики (MP от microplastic) очень легко перемещаются между водной, наземной и атмосферной средой. Считается, что большинство MP попадают в морскую воду, где они могут накапливаться на поверхности воды, опускаться на дно или попадать в организм морских организмов.
Все больше данных демонстрирует, что MP присутствуют не только в дикой природе, но также могут быть обнаружены в кровотоке человека, плаценте в кишечнике и тканях легких, потенциально влияя на здоровье человека.
Обычные методы переработки не работают для MP, потому научное сообщество пытается найти альтернативу. Из множества вариантов стратегий механической и химической переработки одной из самых потенциальных является использование модифицированных клеток для деполимеризации микропластика и переработки этих мономеров в новые полимеры или продукты с добавленной стоимостью. Преимущество инженерных клеток заключается в том, что они работают при температуре окружающей среды, просты в изготовлении и выполняют химические процессы с высокой селективностью.
Хотя биологическая «переработка» фрагментов полимерного происхождения происходит относительно быстро (что позволяет синтезировать полимеры, такие как полигидроксиалканоат, или неполимерные продукты с добавленной стоимостью, такие как ванилин или бетакетоадипат), этапом, ограничивающим скорость, в таком подходе является деполимеризация пластмасс до метаболизируемых фрагментов. Это связано с тем, что большинство пластиков, будучи синтетическими материалами, не поддаются биоразложению, за исключением биоразлагаемых пластиков, таких как полимолочная кислота. Исключением из этого правила являются полиэстер и нейлон, которые содержат минимально реакционноспособные функциональные группы, имеющие сходство с биотическими соединениями, такими как кутин и белки, и, следовательно, обладают потенциалом биоразложения.
Среди разнообразных пластиков наибольшее внимание в области биоразлагаемости уделяется ПЭТ (полиэфиртерефталат; PET), что связано с его невероятной распространенностью. Несколько ферментов, гидролизующих ПЭТ (PHE от PET hydrolyzing enzyme), были идентифицированы и сконструированы. В частности те, которые обнаружены в растительном компосте (из-за структурного сходства между ПЭТ и лигнином), а также фермент, выделенный из бактерии Ideonella sakaiensis (Is), растущей при переработке ПЭТ-бутылок.
Большинство PHE, идентифицированных из растительного компоста, представляют собой термофильные ферменты, которые изначально термостабильны и высокоактивны при повышенных температурах. Хотя эти термофильные ферменты полезны для деполимеризации ПЭТ, поскольку они стабильны и активны при температуре стеклования ПЭТ, они могут потребовать более высоких затрат энергии в процессе переработки. В отличие от термофильных PHE, IsPETase, выделенный из Is, был идентифицирован как наиболее эффективный фермент для деполимеризации ПЭТ в моно(2-гидроксиэтил)терефталат (MHET от mono(2-hydroxyethyl) terephthalate) в условиях окружающей среды. С последующим гидролизом в MHET другой фермент (IsMHETase, также идентифицированный как Is) может превращать MHET в терефталевую кислоту (TPA от terephthalic acid) и этиленгликоль (EG от ethylene glycol), которые обычно используются в качестве сырья для биологической переработки.
Предыдущие исследования продемонстрировали биологическую деполимеризацию ПЭТ через сам Is или через отображение PHE на поверхности Pichia Pastoris или Escherichia coli UT5600. Было показано, что модифицированная бактерия Pseudomonas putida KT2440, которая может использовать исходные сигналы секреции Is на IsPETase и IsMHETase, конвертирует бис(2-гидроксиэтил)терефталат (BHET от bis(2-hydroxyethyl) terephthalate), основной продукт хемокаталитического гликолиза ПЭТ, в β-кетоадипиновую кислоту.
Ключевым ограничением этих четырех организмов является то, что их рост подавляется высокими концентрациями соли, которая присутствует в микропластиках, полученных из океана, учитывая, что морская вода обычно содержит около 3.5% (масс./об.) растворенных солей. Следовательно, для промывки потребуется большое количество пресной воды, что неэффективно и невыгодно. Примечательно, что бактерия Vibrio natriegens (Vn) является умеренным галофилом и хорошо растет при концентрации соли до 4.0% (мас./об.). Это также самый быстрорастущий из известных в настоящее время микробов: время удвоения при оптимальных условиях составляет всего 10 минут.
Кроме того, Vn исследовался как основа для приложений синтетической биологии. В недавнем исследовании индуцированные солью промоторы были идентифицированы в Vn посредством анализа транскриптома. Это открытие сделало Vn потенциальной платформой для устранения загрязнителей морской среды, включая ПЭТ. Однако в этом исследовании для деградации ПЭТ требовался лизис клеток из-за отсутствия сигнального пептида секреции для эффективной секреции IsPETase. Ученые решили проверить гипотезу о том, что Vn можно сконструировать так, чтобы он стал биопластивным организмом для восстановления микропластика в условиях высокого содержания соли без нарушения целостности клеток.
Подготовка к опытам
Химически компетентная Escherichia coli (E. coli) NEB5α (NEB #C2987H) использовалась для всех плазмидных конструкций и инкубировалась при 37 °C со встряхиванием при 250 об/мин в среде Миллера (BD B244610) с добавлением 100 мкг/мл ампициллина для поддержания плазмиды. Vmax X2 (Vibrio natriegens 14048 dns::LacI-T7-RNAP) использовали в качестве конечного шасси для всех сконструированных плазмид и цельноклеточного катализатора. Штаммы Vibrio natriegens культивировали при 30 °C со встряхиванием со скоростью 250 об/мин в среде LBv2 или среде M9v2, которая представляет собой минимальную среду LB или M9 (3 г/л KH2PO4, 6.78 г/л Na2HPO4, 0.5 г/л NaCl, 1 г/л NH4Cl, 2 мМ MgSO4, 0.1 мМ CaCl2 и 18 мкМ FeSO4), дополненную солями v2 (204 мМ NaCl, 4.2 мМ KCl и 23.14 мМ MgCl2) и 100 мкг/мл ампициллина. Исходные растворы BHET готовили в диметилсульфоксиде (DMSO) в 100-кратной концентрации (40 г/л).
Плазмиды конструировали с помощью Gibson Assembly с использованием NEBuilder HiFi DNA Assembly (NEB #E2621). Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы компанией Eurofins. Последовательности генов IsPETase, IsMHETase и FAST-PETase без сигнала секреции от Is были взяты из предыдущих работ и синтезированы Twist Bioscience, как и оптимизированная по кодонам последовательность IsPETase (с использованием GeneGA56) для Vn. Последовательности EcLpp’Omp амплифицировали из геномов E.coli BL21(DE3) посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Гомолог EcLpp’Omp в Vn (VnLpp’Omp) был идентифицирован с помощью программного обеспечения BLAST и амплифицирован из генома Vn таким же образом. Эти кодирующие последовательности были дополнительно вставлены в вектор pUC19 (NEB; N3041AVIAL) после промотора lac.
IsPETase и coPETase были слиты на C-конце EcLpp’Omp и VnLpp’Omp для отображения на поверхности Vn (V059, V060). Для создания двухферментной системы C-конец IsMHETase был связан с N-концом IsPETase с помощью гибких глицин-сериновых линкеров (GS от glycine-serine) и помещен после поверхностных якорей (V061, V073). FAST-PETase заменила IsPETase дикого типа в экспериментах по изучению этого фермента (V078–V081). В качестве отрицательного контроля также были созданы штаммы, внутриклеточно экспрессирующие ферменты, путем удаления поверхностных якорей с С-конца (V070–V072, V082, V083).
Для проверки сконструированных плазмид проводили ПЦР тест колоний на трансформантах NEB5α. Все кодирующие области сконструированных плазмид были проверены с помощью секвенирования по Сэнгеру, а плазмиды с очень длинными кодирующими последовательностями, например, экспрессирующими IsMHETase-[GS]6-IsPETase, были дополнительно проверены с помощью секвенирования всей плазмиды.
После конструирования и проверки плазмиды экстрагировали из NEB5α, а затем трансформировали в Vn. Три разных трансформанта Vn для каждой конструкции были сохранены в виде замороженных исходных материалов для получения трех биологических повторов. Замороженные исходные штаммы Vn и E. coli готовили путем смешивания 500 мкл клеточной культуры с 500 мкл 50% об./об. раствора глицерина в воде и хранили при температуре 80 °С.
Для приготовления культуры свежего цельноклеточного катализатора замороженные исходные образцы трех биологических повторов для каждой конструкции Vn наносили штрихами на чашки с агаром LBv2, дополненным 100 мкг/мл ампера, и инкубировали в инкубаторе при 30 °С. После инкубации отдельные колонии из каждого повтора инокулировали в среду Lbv2 для культивирования в течение ночи при 30 °С со встряхиванием при 250 об/мин. Клеточные культуры далее субкультивировали в 15 мл свежей среды LBv2 с исходной OD600 = 0.03 в течение 1.5 часов для достижения ранней экспоненциальной фазы (OD600 = 0.4) с последующей индукцией 1 мМ изопропил-ß-Dтиогалактопиранозидом (IPTG от isopropyl-ß-Dthiogalactopyranoside) в течение еще 3.5 часов. Культуру клеток собирали центрифугированием при 3000 g (g – относительная центробежная сила ) в течение 5 минут. Среду M9v2 добавляли в концентрированные осадки клеток для достижения исходной OD600 = 6.0 или 12.0 по мере необходимости.
Для тестирования BHET гидролизной активности в смесь добавляли BHET в конечной концентрации 400 мг/л. Реакции проводили в планшетах с 96 лунками с объемом лунки 1 при 30 °С со встряхиванием при 900 об/мин в течение 24 часов. Для экспериментов по разложению частиц ПЭТ порошок ПЭТ суспендировали в DMSO до 100 г/л, затем разбавляли в 100 раз в среде, дополненной 0.4% (мас./об.) глюкозы. Чтобы предотвратить испарение, реакции с частицами ПЭТ в качестве субстрата проводились в пробирках клеточного реактора емкостью 50 мл с общим объемом культуры 6 мл.
Чтобы остановить каталитическую реакцию в целых клетках, образцы центрифугировали при 3000 g в течение 5 минут, затем смешивали с равным объемом 100% метанола с последующей термообработкой при 85 °C в течение 10 минут. Образцы фильтровали через мембрану из wwPTFE с размером пор 0.2 мкм перед проведением анализа высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC от high-performance liquid chromatography).
Результаты опытов
Изображение №1
Поверхностное отображение IsPETase на поверхности Vn обеспечивает быстрый гидролиз BHET. Механизм катаболизма ПЭТ с помощью Is состоит из двух ключевых этапов.
Сначала Is секретирует PETase внеклеточно для фрагментации ПЭТ. Затем MHET диффундирует через порин внешней мембраны и попадает в периплазму, где липопротеин, заякоренный на внешней мембране, IsMHETase, далее гидролизует MHET до TPA и EG, как показано на 1A.
Чтобы избежать диффузной потери ферментов, было решено сконструировать клетки Vn для отображения IsPETase и IsMHETase на их поверхности (1B). Этот подход имеет потенциальные преимущества, заключающиеся в одновременном контакте нескольких IsPETase с ПЭТ, тем самым увеличивая деполимеризацию и увеличивая локальную клеточную концентрацию ТРА и EG для дальнейшего метаболизма.
Неофициальные данные свидетельствуют о том, что слияние рекомбинантных белков с белком А внешней мембраны липопротеина E. coli (Lpp’OmpA) реализует их поверхностное отображение на Vn. Lpp’OmpA состоит из двух частей: одна из основного липопротеина (Lpp), а другая — из белка А внешней мембраны (OmpA). Область Lpp включает в себя сигнальный пептид, за которым следуют первые девять остатков, которые помогают белку прикрепиться к внешней мембране. Фрагмент OmpA сворачивается в структуру β-бочонка, которая обеспечивает трансмембранный домен поверхностного якоря. Ученые соединили либо IsPETase, химеру IsPETase и IsMHETase, либо недавно созданную версию IsPETase (называемую здесь FAST-PETase) с Lpp’Omp E. coli (EcLpp’Omp) или с ее гомологом в Vn (VnLpp’Omp). В некоторых тестах IsPETase была дополнительно оптимизирована по кодонам для Vn, а ее вторичная структура была оптимизирована с использованием GeneGA при слиянии с VnLpp’Omp — этот оптимизированный ген обозначен как coPETase. Все последовательности экспрессировались под контролем промотора lac и трансформировались в клетки VmaxX2, которые созданы для экспрессии LacI. Дополнительно были созданы контрольные штаммы, в которых те же ферменты экспрессировались внутриклеточно без поверхностного якоря.
Чтобы проверить, функциональны ли PHE, отображаемые на поверхности, ученые сначала исследовали, может ли сконструированный Vn гидролизовать BHET. Была выполнена культивация сконструированных клеток Vn в среде LBv2 (2.44% мас./об. солей) и индукция экспрессии PHE. Культуру клеток концентрировали до OD600 = 6 и инкубировали в среде M9v2 без источника углерода (2.56% солей), содержащей 400 мг/л BHET, при 30 °C и pH = 7.5. Образцы отбирали через регулярные промежутки времени в течение 24 часов, а затем проводили центрифугирование, термическую дезактивацию и фильтрацию для подготовки HPLC проб. TPA, MHET и BHET были количественно определены с помощью HPLC для измерения активности гидролиза BHET сконструированных штаммов (схема ниже).
Изображение №2
Сравнение показало, что контрольные штаммы, экспрессирующие только поверхностные якоря EcLpp’Omp или VnLpp’Omp и внутриклеточно экспрессирующие IsPETase, демонстрируют низкий уровень гидролиза BHET (конверсия 0% и 5% в течение 3 часов для V023 и V024; конверсия 21% и 33% в течение 3 часов для V071 и V072).
Изображение №3
Этот фоновый уровень деградации BHET может быть вызван продукцией неспецифической гидролазы, свободной IsPETase, высвобождаемой в результате лизиса клеток, или непреднамеренным экспортом IsPETase. Кроме того, возможно, что BHET диффундирует через клеточную мембрану и достигает IsPETase, экспрессируемой внутриклеточно.
Однако V059-EcLpp’Omp-IsPETase и V060-VnLpp’Omp-coPETase, демонстрирующие IsPETase на своей внешней мембране, немедленно инициировали деградацию BHET и показали значительно более высокую эффективность гидролиза BHET. Более 95% BHET разложилось после 3 часов инкубации. Каталитические реакции достигли максимальной скорости разложения (0–1.5 ч) 0.192 г/л/ч для V059 и 0.179 г/л/ч для V060 в течение первых 1.5 часов инкубации. Основываясь на этих результатах, эффективность деградации BHET оказалась немного выше при использовании EcLpp’Omp по сравнению с VnLpp’Omp, хотя эта разница не была значительной. Учитывая отсутствие существенной разницы, в последующих экспериментах было решено использовать именно IsPETase.
Затем ученые решили выяснить, позволит ли совместная экспрессия IsMHETase на поверхности Vn производить TPA (1B). Недавно было показано, что слияние IsMHETase с IsPETase через глицин-сериновый линкер улучшает конверсию ПЭТ в ТРА по сравнению с экспрессией отдельных ферментов, возможно, из-за каналирования продукта. Поэтому ученые создали конструкции, отображающие IsMHETase-[GS]6-IsPETase через EcLpp’Omp (V061-EcLpp’Omp-MGSP) и VnLpp’Omp (V073-VnLpp’Omp-MGSP), и проанализировали их способность разрушать BHET (изображение №4).
Изображение №4
Как наблюдалось ранее, V070-MGSP, экспрессирующий IsMHETase-[GS]6-IsPETase внутриклеточно, способен медленно конвертировать BHET в MHET без образования значительного количества TPA. Напротив, комплексы IsMHETase-[GS]6-IsPETase, отображаемые на поверхности, были способны конвертировать более 90% BHET в TPA после 6 часов инкубации.
Скорость деградации BHET этими двумя конструкциями, как правило, была ниже, чем у штаммов, содержащих только IsPETase. Максимальная скорость конверсии BHET для V061-EcLpp’Omp-MGSP достигала 0.071 г/л/ч, а для V073-VnLpp’Omp-MGSP — 0.062 г/л/ч. Причина такого снижения эффективности может быть связана с увеличением сложности отображения клетками белков большего размера или более низкой удельной активностью PETase в белке после слияния.
Учитывая, что в экспериментах с IsMHETase-[GS]6-IsPETase не наблюдалось заметного накопления MHET, ученые решили, что деполимеризация ПЭТ с помощью IsPETase является стадией, ограничивающей скорость, и пришли к выводу, что улучшенные варианты IsPETase могут обеспечить увеличение конверсии BHET в целых клетках.
Изображение №5
Потому было решено протестировать FAST-PETase (мутантную IsPETase), созданную с помощью метода проектирования белковой структуры, управляемой машинным обучением, для замены IsPETase дикого типа. Как показано выше, при тех же условиях реакции, что и в предыдущих опытах, наблюдалась конверсия BHET-MHET 0.211 г/л/ч для V078-EcLpp’Omp-Pfast и 0.202 г/л/ч для V079-VnLpp’Omp-Pfast в течение первых 1.5 часов реакции с использованием только FAST-PETase. В случаях использования химерных штаммов V080-EcLpp’Omp-MGSPfast и V081-VnLpp’Omp-MGSPfast в течение первых 4.5 часов достигалась конверсия 0.075 и 0.069.
Наконец, ученые решили проверить, могут ли эти BHET-разлагающие штаммы деполимеризовать частицы ПЭТ. Чтобы исследовать степень деполимеризации ПЭТ в среде, подобной морской воде, ученые инкубировали штаммы Vn в тех же условиях, что и ранее, за исключением того, что частицы ПЭТ 1 г/л (диаметр < 300 мкм, кристалличность > 40%) были заменены на BHET и 0.4 г/л глюкозы. Эта дополнительная глюкоза служила источником углерода для продления жизнеспособности Vn в течение 7-дневной инкубации и стимулирования разрушения пластика, содержащего остаточную биопленку или пищу.
Изображение №6
Судя поданным из графиков выше исключительно штаммы, демонстрирующие внеклеточную IsPETase, обеспечивают деполимеризацию ПЭТ. В ходе реакции низкие уровни МГЭТ (0.1–1.0 мкМ) стабильно наблюдались только у штаммов с поверхностным отображением. Этот MHET, по-видимому, впоследствии был преобразован в TPA, предположительно за счет беспорядочной активности IsMHETase. Контрольные штаммы, экспрессирующие только поверхностный якорь или экспрессирующие IsPETase внутриклеточно, не вызывали заметной деполимеризации частиц ПЭТ после 7 дней инкубации.
А вот штаммы, экспрессирующие химерную IsMHETase-[GS]6-IsPETase, обеспечивали более полный гидролиз, при этом в обеих реакциях с V061 и V073 обнаруживались только следовые количества MHET, а также более высокие общие концентрации TPA (до 3.0 мкМ в течение 7 дней).
Замена IsPETase на FAST-PETase в химере с использованием EcLpp’OmpA в качестве якоря позволила повысить продукцию TPA за тот же период времени (до 4.0 мкМ в течение 7 дней). Однако было обнаружено, что конструкции, использующие VnLpp’Omp в качестве поверхностного якоря, проявляют сходную активность деградации ПЭТ независимо от того, использовалась ли FAST-PETase или IsPETase. Это контрастирует с улучшениями, которые наблюдались при использовании FAST-PETase для любого поверхностного якоря, когда BHET использовался в качестве субстрата. Это наблюдение можно объяснить менее благоприятным поверхностным якорем VnLpp’Omp, который ограничивает превосходную эффективность FAST-PETase, особенно в более сложном процессе деполимеризации частиц ПЭТ, где достижение ферментов может быть более трудным по сравнению с меньшими молекулами, такими как BHET.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.
Эпилог
В рассмотренном нами сегодня труде ученые генетически модифицировали бактерию, дабы она обрела способность расщеплять частицы микропластика в морской воде.
Классический метод борьбы с загрязнением заключается в уборке. Имеется в виду сбор и переработка отходов, в том числе и пластиковых. Но, когда эти отходы плавают в океанах и морях (на поверхности, в толще воды или даже оседают на дно), сбор сильно осложняется. Если же учитывать тот факт, что многие пластиковые отходы присутствуют в виде мелких частиц (до 3 мм), то о сборе и речи быть не может.
Следовательно, необходимо было найти метод, который позволит этот мусор перерабатывать в среде, где он присутствует. На роль главных героев своего исследования ученые выбрали два вида бактерий — Vibrio natriegens и Ideonella sakaiensis. Первый вид отлично чувствует себя в соленой воде и крайне быстро размножается, а второй вырабатывает фермент, позволяющий расщеплять ПЭТ. Получается, что каждая из бактерий обладает весьма полезным свойством, но лишь одним. И ту на помощь приходит клеточная инженерия и генные модификации. Ученые взяли ДНК I. sakaiensis, которая отвечает за выработку ферментов, расщепляющих пластик, и включили эту генетическую последовательность в плазмиду, которая затем была внедрена в бактерии V. Natriegens. В результате этой процедуры бактерии V. Natriegens начали вырабатывать необходимые для расщепления ПЭТ ферменты на своей поверхности.
Во время практических испытаний полученная бактерия прекрасно справлялась с ПЭТ микропластиком при комнатной температуре в соленой воде. Авторы исследования считают, что их творение это лишь первый шаг. В будущем они намерены продолжить свою работу, чтобы улучшить свойства бактерий. В частности необходимо внедрить ДНК I. sakaiensis непосредственно в геном V. Natriegens, что сделало бы выработку ферментов, разлагающих пластик, более стабильной особенностью модифицированных организмов. Также необходимо модифицировать бактерию так, чтобы она питалась продуктами разложения ПЭТ. Еще одним полезным свойством была бы возможность бактерии расщеплять ПЭТ до составляющих, которые могут быть использованы человеком, например, в химической промышленности. В любом случае, использование микроорганизмов для решения глобальных проблем, как показывает данное исследование, может оказаться не просто достойным обсуждения, но и абсолютно реальным методом.
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
