Исследователи разработали методику внутриклеточного модифицирования белков, позволяющую интегрировать неконвенциональные аминокислоты и химические маркеры в естественные белки млекопитающих с минимальными нарушениями их функций. Данная технология, описанная в журнале Science, решает основные недостатки существующих методов, таких как использование флуоресцентных меток или химическое мечение, которые нередко изменяют свойства белков и не предоставляют временного контроля.
Основой метода является применение двух пар разъединённых интеинов — элементов, которые способны саморасщепляться и соединять полипептидные цепи. Система функционирует на основе замены внутреннего сегмента целевого белка на донорный пептид. Для этого вносят в геном клетки акцепторный участок, служащий «целью» для редактирования. Затем в клетку вводят рекомбинантный донорный белок, который содержит требуемые модификации: неконвенциональные аминокислоты (ncAAs) или химические метки. Согласованное действие интеинов позволяет заменять сегмент всего за 10 минут, что важно для изучения быстрых биологических процессов.
Ключевое преимущество технологии заключается в работе с природными белками, которые сохраняют свою естественную структуру и взаимодействия. Например, редактирование киназы Chk1 и транскрипционного фактора c-Myc не нарушило их функционирование, что было подтверждено протеомным и транскриптомным анализами. Это делает метод практически «незаметным», в отличие от подходов с большими метками, которые могут блокировать активность белков.
Для введения ncAAs, таких как p-азидофенилаланин (pAzF), учёные использовали расширение генетического кода в бактериях Escherichia coli. Это позволило добавлять к белкам «химические ручки» для дальнейшего мечения малыми молекулами посредством клик-химии. К примеру, метки на основе биотина или флуорофоров можно вносить без использования антител, что минимизирует фон в экспериментах.
Технология также демонстрирует значительную гибкость: донорный белок можно модифицировать in vitro до его введения в клетку, и редактирование можно активировать в любой нужный момент. Это открывает возможности для изучения динамики посттрансляционных изменений или активации сигнальных путей в реальном времени.
«Ранее мы были ограничены или статичными метками, или методами, которые требовали генетической модификации целого белка. Теперь мы можем точечно интегрировать нужные элементы, не нарушая его родную структуру», — подчёркивают авторы.
Новый подход уже вызвал интерес среди биотехнологических компаний, оценивших его потенциал для создания терапевтических белков с улучшенными характеристиками. Однако основное поле применения — фундаментальные исследования, где точное манипулирование белками в живых клетках поможет раскрыть механизмы заболеваний и ускорить разработку терапий. Следующий шаг — адаптация метода для in vivo моделей, что приблизит его к использованию в доклинических испытаниях.
Источник: iXBT
