SENS-Диагностика. Биомаркеры внутриклеточного «мусора»

В течение всей жизни организма в клетках образуются компоненты, которые в силу разных причин становятся не способны нормально выполнять свои физиологические функции. Такие структуры, как, к примеру, старые дефектные митохондрии, становятся внутриклеточным «мусором». Если бы такой балласт постоянно накапливался внутри клетки, это бы сделало невозможным протекание нормальных внутриклеточных процессов и привело бы к гибели клетки. Чтобы этого не происходило, в клетках существуют специальные «мусоросжигательные заводы» – лизосомы.

Лизосомы – это одномембранные органеллы диаметром от 0,2 до 2 мкм. Для того, чтобы вместить в себя предназначенные для деградации клеточные структуры, лизосомы способны принимать самые разные формы. В среднем, в одной клетке может быть несколько сотен лизосом. Деградация предназначенных для утилизации клеточных компонентов и макромолекул происходит в лизосоме под воздействием специальных расщепляющих ферментов (всего — около 60 различных типов), главный из которых – кислая фосфатаза.

С течением времени и под воздействием различных факторов лизосома может начать хуже справляться со своими задачами. Что приводит к накоплению «внутриклеточного мусора», мешающего жизнедеятельности клетки. Особенно эта проблема актуальна для постмитотических клеток, таких как клетки сердечных мышц и нейроны. Прогрессирующее накопление внутриклеточного «мусора» во приводит к нарушениям нормального функционирования клеток, что может привести к возникновению заболеваний и ускоренному старению.

Отложения липофусцина в клетке сердца. Лф — липофусцин, м — митохондрия, мф — миофибрилла

Характерным примером такой засорившейся клетки может служить наш иммунный страж – макрофаг. Известно, что макрофаги, одна из функция которых – защищать внутренние стенки артерии, одновременно являются ключевым звеном в развитии атеросклероза. В здоровом и молодом организме макрофаги вполне справляются со своей задачей, поглощая и деградируя опасные для артерий вещества, такие, как модифицированные липопротеины. Но если таких веществ в артериях становится больше, чем способен переварить макрофаг, токсичные материалы накапливаются внутри него. И это приводит к дисфункции макрофага и превращению его в пенистую клетку, которая уже непосредственно негативно участвует в развитии атеросклероза.

Авторы концепции SENS видят решение проблемы возрастного и патологического накопления внутриклеточных отходов в модификации лизосом. Они предполагают, что поскольку основная проблема заключается в неспособности лизосом разрушить часть внутриклеточных включений, логичным решением является поставка лизосомам новых ферментов, которые могут смогут с этой задачей справиться. Как сегодня известно, такие ферменты существуют, например, в почвенных бактериях и грибах, разлагающих органические остатки. Таким образом, идея SENS состоит в том, чтобы найти ферменты, используемые этими организмами для переваривания лизосомальных отходов, изменить их, чтобы они могли работать в среде лизосом человека, а затем доставить их в клетки.

На первый взгляд такой подход может показаться технически трудновыполнимым, но уже существуют прямые доказательства его жизнеспособности. Они были получены при лечении генетических патологий, т.н. лизосомных болезней накопления (Lysosomal Storage Diseases), таких, как болезнь Гоше, с использованием «ферментной заместительной терапии». Эти заболевания имеют генетическую природу, в результате чего ферменты лизосом не работают так, как надо. И сегодня ряд таких заболеваний успешно лечится путем инъекции пациентов модифицированным для перемещения через клеточную мембрану ферментами лизосом. Дальнейшая работа в этом направлении продолжается, с использованием генной терапии, чтобы перегруженные отходами клетки начали сами производить необходимые для деградации «мусора» ферменты.

Одним из видов внутриклеточного «мусора», который также может служить биомаркером старения, сегодня считаются гранулы липофусцина. Липофусцин – это пигмент, состоящий из окисленных и поперечно-сшитых белков и липидов, что затрудняет его деградацию и выведение из клеток. Липофусцин был открыт Р. Вирховым ещё в 1847 году. Но, несмотря на это, до сих пор не существует ясного понимания ни механизмов его образования, ни его роли в организме вообще и в процессах старения в частности.

Сам термин «липофусцин» был введён в научный оборот в 1912 году и буквально обозначает «тёмный жир», из-за коричневого цвета пигмента. До этого гранулы липофусцина называли «цероидами», по месту их образования – в гепатоцитах, в подверженной циррозу печени. Размер гранул колеблется в среднем от 0,5 до 1,5 мкм. Сегодня липофусцин найден в клетках всех живых видов, от простейших до приматов. Что ставит под сомнение сугубо патологическую роль липофусцина, почему-то закрепившегося эволюцией у всех живых организмов. С другой стороны, липофусцин может принимать участие в запрограммированной гибели организмов, которую описывает предложенная академиком В. Скулачёвым теория феноптоза.

В состав липофyсцина входят жиры (20-50%), белки (30-60%). Жиры большей частью представлены фосфолипидами (кефалин, лецитин, сфингомиелин), а также холестерином, триглицеридами и продyктами перекисного окисления и полимеризации жирных кислот. В состав гранул липофyсцина могут входить все известные аминокислоты, количественное соотношение которых зависит от органа, из которого выделили липофyсцин. Но в наибольшем количестве во всех гранулах липофусцина представлены четыре аминокислоты: глицин, валин, аланин и пролин.

Некоторые протеины липофyсцина относятся к белкам-ферментам, среди которых наибольшее количество кислых фосфатаз (основного фермента лизосом) и неспецифических эстераз. Кроме этого, в гранулах липофyсцина найдены азотистые основания, дериваты бензола, феноловые соединения и неорганические компоненты – yглерод, азот, фосфор, сера, магний и алюминий [1].

Как образовывается липофусцин в клетках? Сегодня на этот вопрос нет точного ответа. Наличие в составе липофусцина лизосомных ферментов (кислых фосфотаз) позволило предположить, что липофусцин может появляться из-за окислительного стресса. В результате которого в клетке накапливаются «резидyальные тельца» – продyкты оксидации и пероксидации липидов, которые не поддаются деградации лизосомальными ферментами. В гранулах липофусцина также обнаруживали митохондриальные ферменты, фрагменты митохондрий и эндоплазматического ретикyлyма. Поэтому природа накопления липофусцина в клетках может быть также связана с разрушением клеточных органелл, которые не были утилизированы лизосомами [2]. Так, митохондрии наиболее подвержены деградации в липофусциновые гранулы (митолипофусцин) [3].

Описано, что железо усиливает образование липофусцина, предположительно, путём повышения перикисного окисления липидов, вызванного железом. Некоторые исследователи выделяют отдельную форму липофусцина, особо богатого железом – гемосидерин. При старении на накопление липофусцина сильное влияние оказывает дисфункция митохондрий и связанный с ней окислительный стресс (и здесь можно увидеть пересечение двух разделов SENS – mytoSENS и lysoSENS). Так, избыточная продукция дефектными митохондриями пероксида водорода приводит к тому, что пероксид диффундирует в лизосомы, перегруженные железом, и усиливает образование липофусцина. Митохондрии также содержат ферритин, который может подвергнуться деградации посредством аутофагии, что даёт дополнительный источник свободного железа для дальнейшего усиления продукции активных форм кислорода. В том числе при восстановлении ионов железа Fe2+ до Fe3+ в реакции Фентона. Усиление окислительного стресса, катализируемого железом, вызывает пероксидативное повреждение лизосом (проницаемость их мембраны), что приводит к утечке железа, и, в свою очередь, увеличивает общий пул железа. И здесь мы наблюдаем целый каскад кросс-каталитических событий, характерных для патологий: дисфункция митохондрий и окислительный стресс приводит к цепи реакций, итогом которых становится увеличение накопления липофусцина. И этот каскад событий непосредственно связан с особой формой клеточной гибели – ферроптозом, который происходит на фоне дефицита одного из антиоксидантов, глутатиона и в условиях избытка железа и окислительного стресса [4].

В разное время высказывались предположения о возможной физиологической роли липофусцина. Так, в составе гранул липофусцина, кроме белков и липидов, советскими исследователями В.Н Карнаyховым и А.Б. Татарюнасом были найдены вещества, активно участвующие в метаболизме клеток – каротиноиды [5, 6]. В связи с этим высказывались предположения, что липофусцин выполняет какие-то функции. Предположительно, он может участвовать в производстве энергии в условиях гипоксии в энергозатратных тканях, к примеру, в мышечной. Так, например, известно, что в клетках мышц количество липофусцина увеличивается под воздействием тяжёлых физических нагрузок.
Но большинство исследователей придерживаются мнения о возраст-зависимом накоплении липофусцина в клетках, что даёт возможность использовать его в качестве биомаркера старения. Пожалуй, наиболее внятно формулирует взаимосвязь липофусцина со старением митохондриально-лизосомальная теория старения. Согласно которой возрастное накопление липофусцина, загромождающего лизосомы, тесно связано с прогрессирующим нарушением аутофагии, окислительным стрессом и дисфункцией митохондрий. Что становится причиной постепенного возрастного накопления поврежденных митохондрий, других органелл и повреждённых белков, и, как следствие, клеточной дисфункции постмитотических клеток, дисфункции органов и старения [7].

Известно, что с возрастом происходит увеличение накопления липофусцина в разных клетках: в клетках мозга, сердца, сетчатки глаза, скелетных мышц, кожи [8]. Для неделящихся клеток возрастная перегруженность липофусцином должна представлять большую проблему. Так, описана негативная роль этого пигмента в нейродегенеративных процессах и его возможная взаимосвязь с нейропатологиями (болезнями Альцгеймера, Паркинсона и др.) [9]. Поэтому использование липофусцина в качестве биомаркера старения кажется вполне логичным.

Для его идентификации в клетках сегодня используется несколько гистохимических реакций: реакция по Хуэку (окрашивание красителем нильским синим), реакция по Шморлю (липофусцин и ещё один пигмент меланин окрашиваются в темно-синий цвет), метод Циля-Нильсона (окрашивание в ярко-красный цвет карбол-фуксином) [10].

Один из популярных сегодня методов определения липофусцина – окрашивание красителем суданом чёрным-B (Sudan-Black-B, SBB) и его связанным с биотином аналогом (под названием GL 13), которые показали свою высокую эффективность в выявлении липофусцина [11, 12].

В 2015 году китайские исследователи описали эффективный метод измерения липофусцина в слюне и плазме крови. Сравнительный анализ уровней липофусцина в слюне и в крови у молодых и пожилых людей показал достоверную корреляцию в сторону его увеличения с возрастом [13]. Что позволяет использовать этот метод для определения липофусцина как биомаркера старения организма.

К сожалению, на данных момент нет эффективных методов ни как замедления накопления липофусцина, ни так и удаления липофусциновых гранул. Так, запатентованная Ульрих Шрэрмайер (Ulrich Schraermeyer) еще в 2008 году малая молекула тетрагидропиридоэфир (tetrahydropyridoethers) хотя и показала обнадеживающие результаты в опыте на макаках, но так и не нашла применения в клинической практике [14].

Нет новостей и об эффектах гипербарической оксигенации на содержание липофусцина в головном мозге [15]. Эффективность мелатонина, изотретиноина, бета-циклодекстрина – «растворителя» как липофусцина, так и атеросклеротических бляшек, и других препаратов требует дальнейших исследований [16-18].

Авторы обзора: Денис Одиноков, Алексей Ржешевский.

Список литературы.

1. А.А. Ефимов, Г.Н. Маслякова. О роли липофусцина в инволютивных и патологических процессах. Саратовский наyчно-медицинский жyрнал, 2009, том 5, №1, с. 111-115.

2. Лугин И.А., Игнатенко В.В., Прокофьева К.С. Современные представления о липофусцине как о биомаркере старения. Синергия наук. 2017. № 18. − С. 1147-1156.
3. Chaplygina, A. V., and N. L. Vekshin. Lipofuscin and mitolipofuscin in organs of young and adult rats. Advances in gerontology. Uspekhi gerontologii 31.2 (2018): 197-202.
4. Ashraf A, Clark M, So PW. The Aging of Iron Man. Front Aging Neurosci. 2018. Mar 12;10:65.

5. Karnaukhov V.N.On the nature and function of yellow aging pigment lipofuscin. Experimental Cell ResearchVolume 80, Issue 2, August 1973, Pages 479-483

6. Татарюнас. А.Б. Липофyсцин в старении и патологии: Автореф. дис. докт. биол. наyк. Вильнюс, 1999. 41 с.

7. Terman A, Gustafsson B, Brunk UT. The lysosomal-mitochondrial axis theory of postmitotic aging and cell death. Chem Biol Interact. 2006 Oct 27;163(1-2):29-37

8. Москалёв А. Молекулярные биомаркеры старения для превентивной медицины. Вестник восстановительной медицины. 2017. №1, с.18-29.

9. Alexandra Moreno-García, Alejandra Kun, Olga Calero, Miguel Medina and Miguel Calero. An Overview of the Role of Lipofuscin in Age-Related Neurodegeneration. Front Neurosci. 2018; 12: 464.
10. Луппа Х. Основы гистохимии, Мир, М., 1980
11. Hanna Salmonowicz and João F. Passos. Detecting senescence: a new method for an old pigment Aging Cell. 2017 Jun; 16(3): 432–434.
12. Konstantinos Evangelou et al. Robust, universal biomarker assay to detect senescent cells in biological specimens. Aging Cell. 2017 Feb; 16(1): 192–197.
13. Feng FK, E LL, Kong XP, Wang DS, Liu HC. Lipofuscin in saliva and plasma and its association with age in healthy adults. Send to Aging Clin Exp Res. 2015 Oct;27(5):573-80.

14. Julien, S. & Schraermeyer, U. Lipofuscin can be eliminated from the retinal pigment epithelium of monkeys. Neurobiology of Aging 33, 2390–2397 (2012).

15. Xu, X., & Guo, D. (2001). The effect of hyperbaric oxygen on memory behavior and lipofuscin content of brain in aged-mice. Journal of Zhejiang Normal University (Natural Sciences), 24(1), 67-69.

16. Gaspar, J., Mathieu, J. & Alvarez, P. 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HPβCD) reduces age-related lipofuscin accumulation through a cholesterol-associated pathway. Scientific Reports 7, (2017).

17. Litvinenko, G. I. et al. Effects of Melatonin on Morphological and Functional Parameters of the Pineal Gland and Organs of Immune System in Rats During Natural Light Cycle and Constant Illumination. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 159, 732–735 (2015).

18. Radu, R. A. et al. Treatment with isotretinoin inhibits lipofuscin accumulation in a mouse model of recessive Stargardt’s macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences 100, 4742–4747 (2003).