До чего дошел прогресс – до невиданных чудес… И одним из таких чудес, безусловно, является возможность читать «книгу жизни» посредством секвенирования нуклеиновых кислот, или, проще говоря, расшифровке их нуклеотидных последовательностей.
До чего дошел прогресс – до невиданных чудес… И одним из таких чудес, безусловно, является возможность читать «книгу жизни» посредством секвенирования нуклеиновых кислот, или, проще говоря, расшифровке их нуклеотидных последовательностей.
Как вы знаете, хранителями наследственной информации в клетке являются молекулы ДНК. ДНК состоит из «кирпичиков» — нуклеотидов, различающихся между собой азотистыми основаниями. А, Т, Г, Ц – вот они, четыре буквы алфавита жизни. Разное сочетание этих букв порождает огромное разнообразие жизни на Земле.
Сейчас эти знания кажутся рядовыми, однако они стали доступны человечеству совсем недавно: так, например структура ДНК была расшифрована в 1953 году, а первый метод секвенирования ДНК появился в 1977. Интересно, что белки начали секвенировать раньше, но мы на этом сегодня останавливаться не будем.
Расшифровка структуры ДНК и последовавшее за ней открытие генетического кода (а также разработка центральной догмы молекулярной биологии) привели к мощному развитию молодой науки – молекулярной биологии. Ученых всего мира привлекала возможность приоткрыть завесу над главной тайной, волновавшей человечество с начала начал – тайной существования жизни. Стали разрабатывать методы, которые позволили бы изучать ДНК с разных аспектов. Прежде всего, был необходим метод расшифровки нуклеотидных последовательностей. Так появилось секвенирование.
Самым первым методом секвенирования ДНК является так называемый «плюс-минус» метод Сэнгера (который, кстати, до сих пор активно используется биологами. Я сама им занимаюсь в ходе исследований). Он чем-то похож на постановку ПЦР, поскольку для постановки реакции используют практически те же реактивы: фермент ДНК-полимеразу (она достраивает новую цепь ДНК), праймеры (короткие последовательности, по которым полимераза узнает, куда ей нужно «пристроиться» на материнской цепи ДНК), смесь из дезоксинуклеотидов (те самые «кирпичики», из которых полимераза строит новую цепь). Один из дезоксинуклеотидов в смеси помечен флуоресцентной меткой. Также в эту же смесь добавляют дидезоксинуклеозидтрифосфаты, включение которых в синтезируемую цепь приводит к невозможности ее дальнейшего синтеза. По образовавшемуся фрагменту можно установить последнюю букву секвенируемого фрагмента ДНК.
Метод секвенирования по Сэнгеру был популярен вплоть до 2000-х годов. Именно с его помощью впервые удалось собрать геном вируса, бактерии, дрожжей и различных эукариотических организмов. Слышали про проект «Геном человека»? Да, он был осуществлен как раз благодаря методу Сэнгера.
Чем так хорош метод Сэнгера? Он относительно прост (особенно, если не вы осуществляете реакцию ха-ха), надежен (как швейцарские часы) – частота ошибок минимальна. Он позволяет «считывать» последовательности до 1000 пар оснований и используется для расшифровки небольших фрагментов генома/генов (если представить, как по таким маленьким кусочкам собирался геном человека, то становится слегка страшно). Например, для моих исследований метод Сэнгера нужен для анализа различий в консервативных последовательностях генов бактерий-возбудителей болезни Лайма. Также секвенирование определенных генов может позволить идентифицировать вид данных бактерий. В общем, штука удобная.
Раньше расшифровку результатов метода Сэнгера осуществляли вручную – при помощи огромных полиакриламидных гелей и проведения электрофореза.
Однако, к счастью, чуть позже создали прибор – секвенатор, который практически все делает сам. Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом, a выстроившиеся в синтезируемую цепочку ДНК меченые нуклеотиды затем регистрируют детекторами флуоресценции, предоставляя возможность считывать последовательность всего секвенируемого ДНК-фрагмента.
Но прогресс не стоял на месте, и в 21 веке на сцену вышли технологии высокопроизводительного секвенирования (New Generation Sequence – NGS). Их позволило ускорить и удешевить определение полной последовательности миллионов геномов организмов, начиная от бактерий и заканчивая человеком. Уже не нужно ставить 100500 реакций секвенирования по Сэнгеру, ведь NGS-секвенатор способен за несколько прочтений выдать последовательность целого генома (зависит от размера генома. Геном бактерии и вируса вы можете получить за одно прочтение, с более крупными организмами придется повозиться. Но, как говорится, любишь науку, люби и сидеть в лаборатории сутками).
Также появилась возможность единовременно оценивать работу генов в организмах, тканях и даже единичных клетках, а также анализировать регуляцию их активности. Стали развиваться новые отрасли науки – геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика и другие. С помощью NGS-секвенирования можно получать последовательности РНК (это сложнее, но это вполне возможно).
Разные методы NGS-секвенирования предполагают разные способы подготовки проб ДНК. Общим этапом для большинства методов является предварительная фрагментация ДНК (при помощи ультразвука или ферментов ДНК разрезается на небольшие кусочки). К обоим концам фрагментированной ДНК «пришивают» ДНК-адаптеры (данная конструкция называется ДНК-библиотекой), необходимые для эмульсионной ПЦР (эПЦР) на магнитных сферах и последующего секвенирования.
Развитие NGS-секвенирование дало скачок для развития биоинформатики. Да, ученым теперь тоже приходится иметь дело с программированием. Биоинформатики работают с различными программами и занимаются расшифровкой большого количества данных. И в глазах «обычных биологов» они выглядят крутыми ребятами. Ну, в моих так точно. Я с программированием на «вы».
Благодаря появлению секвенирования у человечества появилась возможность определения особенностей различных организмов на уровне их геномов. Что это значит? Если говорить о медицине, то достаточно вспомнить недавнюю пандемию COVID-19. Секвенаторы позволили быстро определить отличия одних штаммов коронавируса от других. Также секвенирование значительно облегчает изучение генетической природы заболеваний человека (в т.ч. наследственных) и дает толчок к развитию генной терапии. Но медицина – не единственная сфера применения секвенирования. Можно изучать особенности пород животных и сортов растений (а также открывать ранее неизвестные виды. Благодаря новым данным о геномах зачастую меняется систематика). Можно оценивать разнообразие микроорганизмов в различных средах. Секвенирование помогает палеобиологам открывать ранее не известные особенности вымерших организмов (главное условие – сохранность ДНК. Кстати, без секвенирования не был бы возможен проект о возрождении мамонта).
А относительно недавно секвенирование вышло на новый уровень, поскольку был сконструирован прибор, который по размеру и весу похож на небольшую коробочку (эдакая флешка, подключаемая к компьютеру). Раньше секвенаторы могли занять чуть ли не половину лабораторного помещения. Теперь у ученых появилась возможность легко перемещать секвенатор и работать с ним в «полевых» условиях. Конечно, пока прибор не идеален (кому интересно, это нанопоровый секвенатор MinION. В России буквально недавно выпустили аналог Нанопорус), но, как показывает практика, через пару лет он наверняка будет усовершенствован. В любом случае, вполне возможно, что начинается новый этап секвенирования нуклеиновых кислот, который обязательно изменит науку и нашу жизнь. Надеюсь, к лучшему.
Автор: Екатерина Крупинская
