Представители Oisin работают над платформой, способной избирательно разрушать клетки по признаку внутренней экспрессии этими клетками специфических белков. Их исходными целями являются сенесцентные клетки и раковые клетки. Сначала они собираются вывести на клинические испытания противораковую терапию, поскольку успешные методы лечения рака проще провести через регуляцию, чем многие иные терапии.
Это позволит им вновь использовать технологию, готовясь к последующим испытаниям сенолитической терапии, способной вычищать многие сенесцентные клетки из разных тканей. На конференции Undoing Aging, организованной SENS Research Foundation и Forever Healthy Foundation в начале 2018 года, Oisin Biotechnologies CSO Джон Льюис рассказывает об их технологии и новых результатах.
Выступление
Добрый вечер всем! Очень приятно быть на этой встрече. Я искренне благодарю Обри де Грея и Майкла Грева за приглашение. Я не мог и просить о лучшей последовательности выступления, поскольку предыдущий спикер проделал фантастическую работу по освещению причин, по которым сененсцентные клетки важны, а также почему они являются такой проблемой. Я академический учёный, работающий в онкологии, и новичок в сфере старения, хотя у меня много опыта в уничтожении клеток, и об этом я бы хотел рассказать сейчас: как Oisin Biotechnologies разрабатывают очень селективную терапию для уничтожения сенесцентных клеток и рака.
Я не буду много рассказывать, что такое сененсцентные клетки, или что они делают. В нескольких словах – это клетки, которые возникают в организме, как реакция на внешние стрессы – окислительный стресс, генотоксический стресс, и они в основном препятствуют развитию рака. Важно также отметить, что по мере того, как клетки становятся сененсцентными, они также посылают сигналы, распространяющиеся в организме. Я повторю, что у нас нет универсальных маркеров сененсцентных клеток. Есть общие черты, которые мы можем использовать в их распознавании.
Например, накопление активных энзимов в лизосомах. Мы можем окрашивать активную β-галактозидазу. Но на самом деле это очень гетерогенная популяция, и они возникают по-разному. Я не хочу подробно останавливаться на связях, я просто подчеркну, что инициация завершения клеточного цикла регулируется несколькими факторами: p16, p21, p53. Мы размышляли об этом и спросили: каковы общие пути, на которые мы могли бы нацелиться, чтобы создать целевую терапию, устраняющую эти клетки? Мне не нужно повторять, что в то время как сенесцентные клетки участвуют в процессах старения, существуют также очень специфические заболевания, которые являются симптомами старения, и которые можно лечить этими же приёмами клинически.
Это был важный момент в прошлом разговоре, что p16 может не быть всей историей. Но вам нужно взглянуть на данные, которые были изучены за прошлые несколько лет – и это действительно меня убедило – что, конечно, все сенесцентные клетки могут и не экспрессировать p16, но в модели мыши очень ясно, что если вы спроектируете её таким образом, чтобы вы могли выборочно уничтожать все клетки, экспрессирующие p16, вы получите феноменальные изменения в фенотипе. Для меня это было очень впечатляюще.
Например, работа Джона ван Дейрсена, в которой были генетически изменённые мыши, экспрессирующие суицидальный ген, приводимый в действие промотором p16, используя так называемую INK-ATTAC систему каспазы-9, которая позволяет им использовать димерайзер, активирующий апоптоз в клетках, которые экспрессировали p16. И эти мыши показали феноменальные изменения в их фенотипе. Значительные улучшения в здоровье, на 25% увеличение средней продолжительности жизни, на 50% меньше рака, а также функциональные изменения: уменьшение образования катаракты, уменьшение немощи, уменьшение потери волос.
Я покажу, качестве вступления к моей лекции, некоторые данные, которые недавно вышли. Они заставили меня задуматься, что это было бы чем-то стоящим как терапия, – это работа Питера де Кейзера, опубликованная в прошлом году, с использованием p53 и FOXO4 механизмов. Он смог использовать ускоренную модель старения, мышей, которые теряют волосы, становятся немощными, и показал: убирание сенесцентных клеток после того, как эти изменения уже произошли, может изменить их. Это для меня реально подтвердило факт, что уничтожение сенесцентных клеток – правильный путь развития.
Таким образом, это основа технологии Oisin. Как инженерная группа, мы размышляли, ещё во время разработки терапии, которую мы можем использовать в лечении конкретной болезни, размышляли в целом про старение, и как это может быть использовано в будущем после того, как мы проверим эффективность клинически. Таким образом, мы хотели использовать аналогичную стратегию, используя современные модели животных, разработанные в наше время. Мы хотели разработать что-то, что имеет низкий профиль токсичности, что хорошо переносится, и что-то, что можно повторять циклически. Что-то, что является неиммуногенным и не имеет побочных эффектов. Очевидно, что многие фенотипы старения являются тканеспецифическими, и возможность нацеливать терапию на различные ткани была бы преимуществом.
То, что я собираюсь рассказать вам сегодня, – это технология Oisin, которую мы разработали. Она называется платформой SENSOlytic. Это платформа липидных наночастиц (LNP), которая содержит неинтегрируемую ДНК плазмиду. Она разработана для активации химическим димерайзером, который инициирует очень быстрый и необратимый апоптотический ответ. Возможно, наиболее важной частью этого является система доставки лекарств – способность доставлять плазмидную ДНК системно в разные ткани без значительной токсичности. Oisin разработала многоцелевую технологию на основе плазмиды, и, в отличие от РНК интерференции или информационной РНК, плазмиды могут быть изящно спроектированы, чтобы активироваться лишь при активации специфического пути, таких как p16, p21 или p53. Но они также могут быть спроектированы с помощью энхансеров или репрессоров и нацелены на конкретные ткани или заболевания. Мы создали систему и библиотеку конструкций, которые активны в различных условиях. Две из них, которые я покажу вам сегодня, представляют собой версии промотора p16 и p53, включающие суицидальные гены.
Мы создали библиотеку плазмид, которые в основном представляют собой специфический селективный промотор, связанный с индуцируемым iCas9 суицидальным геном, который затем включается или димеризуется при помощи химического димерайзера. Многие из вас, возможно, видели это раньше, но iCas9 представляет собой изменённую каспазу, поэтому она усечена, домен включения был убран и заменён доменом димеризации FKBP. Эти области очень сильно взаимодействуют с химическим димерайзером AP20187 или его клиническим аналогом AP1903, являющимся безопасным, как было показано во время клинических испытаний II фазы. Что реально хорошо в этой системе, так это то, что вы временно экспрессируете гены вашей плазмиды лишь в клетках с активной экспрессией p16 или p53 в нашем случае. И ничего не происходит, пока вы не добавите димерайзер. Низкомолекулярный димерайзер очень хорошо переносится, насыщает все ткани в течение нескольких минут и вызывает необратимый апоптотический ответ. iCas9 димеризуется в этих условиях, самовыщепляется, включит формирование апоптосомы и вызовет очень быструю гибель клеток в течение 2 – 3 часов. Клетки не смогут этому противостоять. Они не cмогут эволюционировать или иначе противостоять ему.
Некоторые из наших исследований in vitro использовали плацентарную миофибробластную клеточную линию IMR-90. В этом случае мы вызывали сенесцентность, используя 10 греев облучения, и трансфецировали клетки с помощью iCas9. iCas9 немного меньше каспазы-9 и может быть обнаружен с помощью антител к каспазе-9. В клетках, которые не были обработаны излучением, не было никакой экспрессии iCas9. В тех случаях, когда клетки становятся сенесцентными, экспрессируя p16, начинается индукция iCas9, и когда мы добавляем немного димерайзера к этим клеткам, она исчезает. Культура очень быстро очищается от этих клеток. Затем, когда мы смотрим на способность убивать эти клетки, в тестах жизнеспособности мы видим, что каждая клетка, успешно трансфицированная плазмидой, умирает. Мы провели и иные эксперименты. Я просто показываю пример, в котором мы используем проточную цитометрию, и мы подтверждаем, что мы вызываем апоптоз в этих клетках.
Таким образом, у нас есть плазмида, которая очень селективна к клеткам, экспрессирующим p16. Мы можем убить их очень быстро при добавлении димерайзера. Вопрос в том, как мы превращаем это в терапию, которая работает на людях. Нужен механизм доставки, очень эффективный и безопасный. Мы решили использовать липидные наночастицы. Липидные наночастицы использовались в течение многих лет, и я бы сказал, что было много обещаний и инвестиций, и очень мало успехов. Alnylam Pharmaceuticals в Бостоне недавно провела успешное испытание фазы III с препаратом иРНК, и проблема заключается в том, что липидные наночастицы обычно накапливаются в печени, а их механизм доставки нуклеиновых кислот в клетки использует положительный заряд. Это очень простая технология. Они создали липиды с положительным зарядом. Если вы используете положительный заряд, они очень легко пробивают отверстия в мембранах, и вы можете эффективно вносить материал в клетки, за исключением того, что они весьма токсичны. Таким образом, у них очень низкая безопасная доза.
В ответ на это несколько компаний разработали так называемый условно-катионный липид. Это липид, обычно нейтральный в кровотоке, попадая в эндосомы становится катионным в кислой среде. Они являются предметом текущих программ, которые проходят через клинические испытания липидных наночастиц. Они работают, но они всё ещё весьма токсичны. Идеальной системой доставки является та, которая может использовать нейтральные липиды с альтернативным механизмом клеточной доставки нуклеиновых кислот. Я собираюсь рассказать вам немного о том, как мы пришли к нему. Если у вас есть липидная наночастица, и ей нужно попасть внутрь клетки, она должна пройти через плазматическую мембрану со всей её защитой. Вирусы эволюционировали в течение миллионов лет, решая эту проблему, и разработали множество фьюзогенных белков. Эти белки являются красивыми, гигантскими и изящными, и способ, которым они соединяют мембраны вместе, создают поры и смешивают липиды реально фантастичен, но прикрепить их к липидной наночастице нельзя, ибо они являются большими белками с гигантскими активными центрами и высокой иммуногенностью.
К счастью, есть канадский учёный, который всю жизнь изучал эти фьюзогенные орторевирусы, и обнаружил, что они не используют фьюзогенный белок для проникновения в клетки, но как только они попадают в клетки, они заставляют все клетки вокруг них быстро сливаться. Он провёл свою карьеру, характеризуя этот класс связанных со слиянием трансмембранных белков, которые на два порядка меньше самого маленького фьюзогенного белка, экспрессируемого иными вирусами, но достаточны в целях инициирования слияния клеток и, самое главное, липидных наночастиц и клеток.
При включении этих белков в платформу на основе нейтральных липидных наночастиц вы обнаружите, что нейтральные липиды сами по себе крайне плохи в доставке нагрузки. В нашем примере мы используем плазмиду mCherry против раковых клеткок, и поэтому без фьюзогенных белков вообще нет доставки, а с ними мы получаем фантастическую доставку. Таким образом, они увеличивает доставку нейтральной липидной частицы в 80-350 раз, и они хорошо переносятся in vivo. В эксперименте с люциферазой мы инъецируем иРНК, экспрессирующую люциферазу, в хвостовую вену. Мы получаем экспрессию люциферазы по всему телу. Мы замечаем накопление в лёгких и печени, но мы получаем хорошую экспрессию во многих тканях, включая кожу и мягкие ткани по всему телу.
Мы используем нашу платформу в целях доставки полезной нагрузки против сенесцентных клеток. Платформа называется Fusogenix. Она использует нейтральную липидную наночастицу, которая не токсична и хорошо переносится. И она использует эти фьюзогенные белки в целях проникновения в клетку. Я не хочу вдаваться во все мелочи. Нам потребовалось три года, чтобы создать антитела против этих белков, они реально неиммуногенны. Причина этого заключается в том, что большая часть из них является трансмембранными доменами. Они липофильные, поэтому они упаковывают липиды вокруг себя, и они не имунногенны. Мы потратили много времени, улучшая эти фьюзогенные белки, чтобы сделать их лучше. Я не собираюсь вникать во все мелочи, но сейчас у нас есть платформа по их промышленному производству их в большом количестве и лиофилизации, и мы можем их высылать по запросу в целях использования.
Позвольте мне показать вам данные, полученные в эксперименте – в котором взяли активированную p16 каспазу-9 и ввели её в мышей. В этом случае мы провели эксперимент с 16 мышами, пожилой мышиной группы 80 недель. Мы разделили их на три группы, мы ввели им контрольный LNP, без димерайзера, или две дозы, 5 и 10 мг/кг – и 10 мг/кг, – это большая доза. Мы лечили этих животных один раз инъекцией в хвостовую вены. Мы ждали 96 часов, а затем ввели им димерайзер, также внутривенно. Затем мы подождали ещё два дня, собрали ткани, кровь, провели чувствительную RT-PCR, и контролировали её несколькими генами. Мы получили убедительное дозозависимое снижение экспрессии p16 в различных тканях.
Я собираюсь показать вам пару изображений, где мы тратим много времени на оптимизацию окрашивания β-gal у мышей. Это самые лучшие изображения, которые у нас есть, но мы получили в нескольких тканях дозозависимое снижение экспрессии β-галактозидазы. Весьма обнадёживающая информация. Конечно, работы в лаборатории – хорошо, но если мы собираемся перевести это на людей, есть много вещей, которые нужно выяснить. Токсикология чрезвычайно важна. Это важно для лекарственного средства, которое вы собираетесь выполнять циклически, чтобы убедиться, что ы организме не образуется нейтрализующих антител. Таким образом, мы провели много исследований, посвящённых повторному дозированию, и мы не фиксировали никаких антител, поэтому мы можем давать его в повторных дозах без какого-либо снижения эффективности. CARPA – это то, о чем я узнал недавно, коплементарно активируемая псевдоаллергия, иммунная реакция, которую могут иметь многие пациенты, получающие терапию наночастицами, такими как доксил. Мы запустили все анализы, и они имеет более низкий профиль, чем доксил, поэтому они очень хорошо переносится.
Я рад сказать, что мы провели несколько пилотных исследований с приматами, мы ввели им десятикратную максимальную дозу человека, и она была очень хорошо перенесена. Эти обезьяны фактически получили лечение, как p53, так и p16, порознь и в комбинации, и димерайзер, поэтому мы рассчитываем на хорошие данные. Сейчас мы работаем над ними.
Переносимость этих частиц очень важна. Я показываю этот слайд, потому что он показывает все усилия, предпринятые в клинических испытаниях липидных наночастиц и почему они потерпели неудачу. Если вы посмотрите на первые три программы, они были многообещающими десять лет назад, используя катионные липосомы и липидные наночастицы. Вы можете увидеть, что их максимальная переносимая доза составляет менее 1 мг / кг, и эти программы все провалились из-за токсичности, связанной с печенью. Второе поколение, условно-катионные липиды, они переносились в большей или меньшей степени, и некоторые из этих программ были успешными и приведут к утверждению лекарств, но все цели – печень. Поскольку липидные наночастицы накапливаются в печени, вы увидите токсичность, ограничивающую дозу, если вы не используете нейтральную липидную композицию. Затем вы можете увидеть работу с использованием нейтральной липидной композиции, подобной нашей, и они не смогли найти максимально переносимую дозу в одном исследовании. Основываясь на наших исследованиях приматов, отличных от человека, мы ожидаем, что наши частицы будут в равной мере переносимы.
В настоящее время мы оцениваем различные конструкции, чтобы узнать, какую из них лучше всего использовать на человеке, и, очевидно, об этом говорили на этой конференции – создание биомаркеров, которые являются хорошими показателями клинических испытаний, а также в животных моделях оценки эффективности. Мы очень хотим пообщаться с любыми учёными, у кого есть хороший биомаркер. У нас есть группы мышей, в которых мы смотрим на продолжительность жизни и здоровье этих мышей. Мы размышляем о переходе в клиническую фазу, когда мы получим GMP и анализ токсичности GLP.
Поэтому я собираюсь перейти на рак, ибо он наш главный путь в клинику. Моя основная работа – изучение рака предстательной железы. Одна вещь, которая действительно заинтриговала меня связью между старением и раком, – это активация пути р53. Ген p53 является самым мутированным геном в раке, и существует много типов рака, которые имеют высокий мутационный груз в p53. Я беру простату, потому что в ней показатели низки, в среднем они составляют 10%, большинство раков предстательной железы – низкомутабельные. Как только вы попадаете на метастатическое заболевание, этот показатель мутации составляет более 50%. Таким образом, это хорошая цель в лечении рака. Хотя сам р53 белок ещё не был мишенью в онкологических терапиях, я верю, что они очень перспективны. В p53 вы можете получить два типа мутаций. Во время репликации клетки или возникновения мутаций они активируют р53, чтобы либо устранить повреждение, либо пройти апоптоз. Поэтому клетки либо мутируют, либо избавляются от р53, чтобы обойти его. В результате фактические пути активации очень зарегулированы. Так можно ли использовать эту активацию в целях уничтожения раковых клеток?
Я пропускаю всю информацию in vitro, поскольку у меня осталось лишь три слайда, и я хочу показать вам некоторую информацию in vivo, так как это реально важно. В этом случае мы используем очень похожие конструкции, как которые я показал ранее. Существует разработанный промотор p53, управляющий суицидальным геном iCas9, помещённый в нейтральную наночастицу. В этом примере мы выращиваем гигантские опухоли рака предстательной железы у мыши с ослабленным иммунитетом. Мыши линии NOD/SCID. Мы выращиваем их до 500 мм3. Мы делаем одну внутриопухолевую инъекцию наночастиц, ждём три дня, а затем делаем системную инъекцию димерайзера. Мы увидели, что большинство опухолей сократилось на 90-95% за 48 часов – и это не удивительно для внутриопухолевой инъекции, но я был очень счастлив, потому что это означает, что наша плазмида успешно заработала в большинстве опухолевых клеток, что весьма интересно.
Настоящим доказательством является возможность делать системные инъекции, и мы провели эти исследования. Это всего лишь пример четырёх мышей в этой группе. Мы выращивали эти очень большие опухоли, выращивая их до размера 500 мм3. В этом случае мы делаем четыре ежедневных инъекции LNP в хвостовую вену, а на пятый день мы даём им одну дозу димерайзера системно. Опять же, мы увидели замечательные результаты: уменьшение опухоли на 50-98% всего за два дня. Это привело к значительному увеличению выживаемости при однократной инъекции у этих животных. В среднем у шести мышей на группу почти на 70% уменьшаются объемы опухоли.
Вещь, которая очень важна: первичные опухоли не убивают пациентов в большинстве случаев. Это метастатическая болезнь, поэтому нам очень интересно узнать, сможем ли мы излечить метастатический рак. Очевидно, мы возьмём такие случаи и в первые клинические испытания. Таким образом, мы сделали ряд моделей, изучающих способность LNP контролировать метастатическую болезнь, в этом случае у нас есть модель системного метастазирования рака предстательной железы и модель иммунокомпетентной меланомы. В обоих случаях в режиме многократного использования мы смогли эффективно контролировать это заболевание.
Мы на верном пути. Ясно, что перспективной целью Oisin является разработка средств, убивающих сенесцентные клетки. Но я уверен, что в краткосрочной перспективе очень важно, не только для технологии наночастиц, но и для всей платформы, показать в клинике её безопасность и эффективность. Итак, мы уже разработали клинические испытания фазы I / фазы IIb по лечению рака, и сейчас мы готовимся к проверке токсикологии GLP, которая будет способствовать этим исследованиям. Мы надеемся на КИ на человеке в начале 2019 года. Мы рады ускорить использование этой технологии. Я также упомяну важную вещь: есть много типов рака, при которых это может сработать. В Канаде мы можем провести фазу I испытания со всеми типами рака, в основном, с колоректальным, простаты, лёгких и иных. Мы будем искать наибольшой успех в лечении и наиболее значимый рак, чтобы иметь возможность расширить эту группу, а затем выполнить фазу II.
