Оптогенетический инструмент управления экспрессией белков in vivo применили для терапии диабета
Загрузка галереи
Китайские ученые создали оптогенетический инструмент, который позволяет точно регулировать экспрессию генов, имитируя нормальную экспрессию в живых системах. Представленная ими схема поможет глубже изучить механизмы экспрессии генов в клетках животных. В рамках работы, опубликованной в Nature Communications, исследователи также продемонстрировали потенциальное применение молекулярного инструмента в качестве терапии диабета первого типа.
Чтобы понимать, как функционирует тот или иной белок, как клетка отвечает на внешние и внутренние сигналы, необходимо иметь возможность анализировать, как именно экспрессируются гены, и, соответственно, вырабатываются белки. Принято считать, что при постоянных внешних условиях концентрация и функции ключевых регуляторных молекул в клетке не сильно меняются или случайным образом колеблются возле фиксированного значения.
Однако многие регуляторные белки, в том числе и транскрипционные факторы, функционируют «пульсирующим» образом и, соответственно, по-разному влияют на клеточную судьбу, ответ клетки на стрессовые условия и дифференциацию. Ученым удалось объяснить механизмы только некоторых таких пульсирующих механизмов. Создание управляемых пульсирующих систем может быть полезным для дальнейшего изучения их механизма и стоящих за ними биологических функций.
Выделение клетками инсулина относится к такой пульсирующей схеме. Инсулин — белковый гормон, который выделяют бета-клетки поджелудочной железы. Инсулин блокирует выделение глюкозы печенью и способствует тому, чтобы клетки использовали глюкозу, поступающую в кровь из пищи.
В исследовательских работах для управления экспрессией генов широко используются влияющие на нее химические вещества. Однако такие химические индукторы долго не распадаются и потому слишком долго влияют на экспрессию. И если в эксперименте на клеточных культурах можно физически убрать воздействующее вещество (поменять среду), то в экспериментах на животных такой возможности нет (нельзя обратно «отобрать» вещество из клеток животного), и практически невозможно динамично регулировать экспрессию, просто добавляя или убирая химическое вещество. Существуют альтернативные системы, в которых экспрессия генов зависит от света, но применение и таких систем сильно ограничено: сложно «доставить» необходимое количество света глубоко в ткани, потому что ткани сами по себе довольно сильно поглощают свет.
Проблема управления белками интересует не только тех, кто занимается экспрессией генов. Ранее нейробиологии разработали химерные белки, которые одновременно обладают и люминесценцией (способностью светиться), и чувствительностью к свету. Такая особенность позволяла им в присутствии субстрата «запускать» самих себя. Эти белки регулировали работу ионных каналов. В отличие от традиционных химических индукторов, субстрат люциферазы — белка, который издает свечение — легко и быстро используется люциферазой, а поэтому ответ белка быстро достигает своего пика и также быстро исчезает, что делает его динамичным.
Группа ученых из Восточно-китайского университета науки и технологий под руководством И Янa (Yi Yang) предложила использовать подобную систему, в которой сочетается химическая и световая регуляция, для управления экспрессией генов в клетках. Ученые решили создать химерный белок, состоящий из включаемого светом транскрипционного фактора и люциферазы. Для этого они соединили модифицированную люциферазу глубоководной креветки NanoLuc и LOV-домен (light-oxygen-voltage), чувствительный к свету белок растений и грибов, в одну молекулу. При этом LOV-домен хорошо поглощает синий свет (длина волны λ = 440–480 нанометров), а люцифераза NLuc как раз вырабатывает синий свет. Воздействовать на такую систему можно двумя способами: непосредственно светом или предоставляя люциферазе ее субстрат фуримазин. Эксперименты показали, что система действительно функционирует как логический элемент «ИЛИ». Экспрессия контролируемого химерным транскрипционным фактором белка возрастала в 116 раз при добавлении фуримазина с концентрацией 2,5 микромоль, и уменьшалась при дальнейшей увеличении концентрации субстрата.
Загрузка галереи
По замыслу ученых, люцифераза в транскрипционном факторе быстро использует предоставленный ей субстрат, и как только он заканчивается, транскрипционным фактор перестает активировать транскрипцию гена. Для того чтобы проверить, насколько созданный ими фактор отвечает ожиданиям, исследователи измерили уровень экспрессии контролируемого им белка в зависимости от времени. Согласно результатам измерений, через 4-6 часов после добавления фуримазина уровень синтеза белка достигал максимума, а затем резко снижался.
Далее исследователи протестировали систему in vivo на животных моделях. Печень мышей трансфицировали плазмидами, в которых экспрессия репортерного флуоресцентного белка контролировалась разрабатываемым химерным транскрипционным фактором. После введения мышам фуримазина, экспрессия репортерного белка также достигала максимум через четыре часа и резко снижалась после. При этом амплитуда уровня экспрессии менялась с концентрацией вводимого фуримазина. Кроме того, экспрессию белка можно было повторно «включать» с интервалами в восемь часов.
В заключение группа ученых показала разработанную ими схему как потенциальный способ терапии диабета. Клетки, в которых выработка инсулина контролировалась химерным транскрипционным фактором, инкапсулировали в полупроницаемую мембрану. Пропускающая только низкомолекулярные соединения (< 72 килодальтон) мембрана защищает чужеродные клетки от физического контакта с иммунной системой животного-хозяина. Мышам с диабетом первого типа выдавали по пять миллиграмм фуримазина на киллограмм массы животного и измеряли содержание глюкозы в крови спустя три часа. Уровень глюкозы у мышей с имплантированными клетками снизился по сравнению с остальными (мышами без импланта, не получившими фуримазин мышами).
Ученые отмечают, что эффект от перорального приема фуримазина был сопоставим с внутривенным и внутрибрюшинным введением вещества. Пероральный способ — наиболее предпочтительный, потому что не вызывает боль и тревожность у животных и людей. К тому же, на данный момент не существует пероральной терапии диабета первого типа — пациенты вынуждены делать внутримышечные инъекции инсулина, чтобы контролировать содержание глюкозы в крови после приемов пищи.
Также исследователи заметили, что оптимальная доза фуримазина, достаточная для поддержания необходимого уровня глюкозы в крови, была разной в зависимости от интервалов времени между приемами пищи. Возможно, это позволит создать клеточную терапию, дозировку которой можно будет корректировать в зависимости от пищевых привычек пациентов.
Возможности методов оптогенетики давно привлекают исследователей, и они часто экспериментируют с их применением на животных. Например, одни ученые внедрили информацию о песнях в мозг молодых амадин, а другие вернули зрение макакам, превратив их нервные клетки в фоторецепторы.
Вера Сысоева
Но сработала только низкая доза
Ученые из США ввели макакам-резус белок Клото. Уровень сывороточного Клото вырос в пять раз после инъекции белка. В итоге обезьяны почти на 20 процентов лучше справились с задачей на память, и эффект не прошел даже после двух недель. Но если на мышах работали разные дозы белка, то макакам хватило 10 микрограмм на килограмм массы тела — большие дозы не улучшали память. Результаты опубликованы в Nature Aging. В конце 20 века ученые открыли белок Клото (Klotho), который назвали в честь древнегреческой богини, прядущей нить жизни. Выяснилось, что мыши с дефектным геном Klotho начинают стареть уже спустя 3–4 недели после рождения, а еще у них развивается остеопороз, атеросклероз и другие патологии, а к двум месяцам они умирают. Мыши, чрезмерно экспрессирующие Klotho, напротив, живут на 20–30 процентов дольше, а их память лучше. Еще сверхэкспрессия белка защищала мозг мышей от повреждений, связанных с болезнями Альцгеймера и Паркинсона. Люди с повышенными уровнями белка тоже живут дольше, их когнитивные способности лучше, а еще у них ниже риск развития деменции и болезни Альцгеймера. В организме синтезируется две формы белка Клото — трансмембранная и секретируемая. В крови еще циркулирует растворимая форма белка, которая получается, когда ферменты отрезают от трансмембранного белка кусок. Растворимая форма может действовать как гормон, влияя на сигналинг инсулина, фактора роста фибробластов (FGF), функцию Wnt и NMDAR. Растворимую форму Клото вводили мышам в виде инъекций, и это повышало синаптическую пластичность, улучшало познание и устойчивость нейронов к старению. Стейси Кастнер (Stacy A. Castner) из Йельской школы медицины и ее коллеги решили проверить, улучшится ли память у нечеловеческих приматов, макаков-резус (Macaca mulatta), если им подкожно ввести белок Клото. Макаки-резус, как и люди, страдают от возрастного когнитивного снижения, хотя и без значительной потери нейронов. Сначала белок Клото макак ученые ввели мышам — в дозировке 10 микрограмм белка на килограмм массы тела. В предыдущих исследованиях такая доза увеличивала синаптические и когнитивные функции мышей. Здесь спустя 4 часа у мышей улучшилась синтетическая пластичность и рабочая память, которую проверяли в У-образном лабиринте. Уровень белка Клото в сыворотке мышей после инъекции увеличился в шесть раз. Затем ученые попытались повысить уровень белка в сыворотке стареющих макак, которым было в среднем около 22 лет (что эквивалентно человеческим 65), до того же уровня. Для этого они вводили макакам разные дозы Клото: от 0,4 до 30 микрограмм на килограмм массы тела. Доза в 10 микрограмм на килограмм повысила уровень сывороточного белка в пять раз. Уровень Клото в человеческой пуповинной крови тоже примерно в пять раз выше, чем в крови взрослых, — поэтому на дозе в 10 микрограмм ученые и остановились. Обезьян учили запоминать расположение отсека с пищевым вознаграждением, и таким образом оценивали их рабочую память. Задачи с нормальной сложностью, в которых было от 4 до 7 отсеков, они выполняли успешно, но не всегда справлялись с повышенной сложностью, когда отсеков было уже от 6 до 9. Уже через четыре часа после однократной инъекции белка Клото макаки стали лучше решать задачу, особенно — ее сложный вариант. Процент правильных ответов в сложной задаче увеличился с 45 до почти 60 (P = 0,0077). Этот эффект сохранялся спустя две недели и не зависел от пола. А вот более высокие дозы — 20 и 30 микрограмм на килограмм массы тела — не привели к когнитивному улучшению у макак, но и хуже не сделали. В отличие от обезьян, на мышей в предыдущих исследованиях высокие дозы белка действовали положительно. Возможно, слишком высокие дозы нарушают метаболизм у нечеловеческих приматов. Авторы предположили, что когнитивного улучшения у людей также можно будет достичь с помощью небольших, физиологических доз гормона. Также ученым еще предстоит выяснить, как сигналы белка передаются в мозг, поскольку введенный в кровь Клото сам не пересекает гематоэнцефалический барьер. Не так давно ученым удалось улучшить рабочую память людей, посветив на мозг лазером — через кожу и череп. До стимуляции люди могли запомнить 3–4 фигуры на картинке, а после — 4–5.