4. Методы определения гликолитической активности микроорганизмов

Сахаролитические свойства, т.е. способность расщеплять сахар и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа чаще всего изу­чают на дифференциально-диагностических средах Гисса, которые содержат питательный агар, тот или иной углевод и индика­тор Андреде (ВР или др.). В зависимости от изучаемого рода и вида бактерий подбирают среды с соответствующими моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза и др.), полисахаридами (крах­мал, гликоген и др.), высшими спиртами (глицерин, маннит и др.), в про­цессе ферментации которых образуются альдегиды, кислоты и газооб­разные продукты (С0₂, Н₂, СН₄).

В состав короткого “пестрого” ряда Гисса входит 5 углеводов: с глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза и сахароза. При некоторых исследова­ниях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами. Название “пестрый” ряд обусловлено тем, что под дей­ствием ферментов микроорганизмов одни углеводы остаются неизмен­ными и, следовательно, цвет питательной среды не меняет­ся, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикато­ра и соответственно цвет питательной среды. По консистенции среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добав­лением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими сре­дами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают “поплавок” — трубоч­ку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. “По­плавок” помещают запаянным концом кверху; при стерили­зации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в “поплавке”, вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек. В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стой­кой пены на ее поверхности. Таким образом, при изучении сахаролитических фермен­тов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в пита­тельной среде конечных газообразных продуктов. Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, со­держащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуе­мой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.

Критерии учета результатов:

• цвет среды не меняется - культура не ферментирует углевод;

• цвет среды изменяется (в случае использования индикатора Андреде – со светло-желтого на красный, ВР – с розового на синий и т. д.) – культура ферментирует углевод с образованием кислых продуктов (органических кислот), пробирку отмечают буквой «К»;

• цвет среды изменяется и наблюдается появление пузырьков газа в среде или поплавке - культура ферментирует углевод с образованием кислых и газообразных продуктов. Такую пробирку отмечают буквами «КГ».

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, Левина, Плоскирева. Микроорганизмы, сбраживая до кислоты находя­щийся в этой среде молочный сахар, образуют окрашенные колонии (кис­лота изменяет цвет индикатора). Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Таблица 17. Дифференциально-диагностические среды

Наименование и внешний вид среды	Состав (компоненты)	Назначение	Принцип действия и внешний вид среды после посева
Среда Эндо Бледно-розовая плотная сре­да, разливается в чашки Петри	Питательная основа-МПА, субстрат - лактоза, индикатор - основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия (Na2SO3)	Для рассева исследуемого материала (нативного или после обогащения) с целью получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных знтеробактерий: эшерихий, сальмонелл, шигелл, йерсиний и других	На среде можно наблюдать рост красных или бесцветных колоний. Эшерихии разлагают лактозу до кислых продук­тов, в том числе альдегидов, они соединятся с сульфитом натрия, при этом освобождается фуксии, который окраши­вает колонии и среду в красный цвет, часто с метал­лическим зеленоватым блеском (положительный результат). Сальмонеллы и шигеллы не разлагают лактозу и образуют бесцветные колонии (отрицательный результат).
Среда Левина Плотная среда красновато-фиолетового цвета. Среда является дифференциально-диагностической и слабо се­лективной, так как оказыва­ет ингибирующее действие на грамположительную микрофлору	Питательная основа-МПА, Субстрат - лактоза. Индикаторы - эозин и метиленовый синий	Для получения изолированных колоний патогенных и условно-патогенных энтеробактерий - см. среду Эндо. Среда Левина может быть использована также для выделения грибов Candida albicans	На среде можно наблюдать рост синих или бесцветных колоний. Escherichia coli, разлагающая лактозу, вызывает сдвиг рН в кислую сторону, при этом комплекс индикаторов эозина и метиленового синего выпадает в осадок и колонии приобретают темно-сине-фиолетовый, почти черный цвет, часто с металлическим блеском (положительный результат). Энтеробактерии не расщепляющие лактозу, образуют бесцветные колонии.
Среды Гисса Набор пробирок с полужидкой средой розового цвета.	Питательная основа - полужидкий МПА (0,4%), Субстрат (в каждой пробирке разный углевод), Индикатор - бром крезоловый пурпурный или BP (водный голубой и розоловая кислота)	Определение спектра сахаролитической активности с целью идентификации (определение родовой и видовой принадлежности) выделенной культуры бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также других семейств и родов.	При ферментации субстрата образуются кислые продукты (молочная, уксусная, муравьиная и другие кислоты), кото­рые снижают значение рН и розовый цвет индикатора изменяется на синий, что указы­вает на положительную реакцию. При образовании газа (Н2 и СО2;) - пузырьки и трещины в толще среды. Рост бактерий в среде Гисса без изменения ее цвета свидетельствует об отсутствии фермента, расщепляющего данный углевод, то есть об отрицательной реакции